環(huán)氧合酶-2在TNF-α誘導的人晶狀體上皮細胞增殖和轉分化中的作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　后發(fā)性白內障（又稱后囊膜渾濁，posterior capsular opacification，PCO）是目前白內障術后最主要的并發(fā)癥，其主要的病理機制是術后殘留的晶狀體上皮在活化或升高的細胞因子等作用下發(fā)生細胞增殖、遷移和上皮向間充質轉分化等。研究發(fā)現腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是白內障術后房水中存在的一種重要的炎癥因子，被認為和PCO的形成有關。另外有研究表明環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX

2、-2)抑制劑在體內實驗和體外模擬實驗中均可以有效地抑制PCO的發(fā)生，但其藥理作用的分子機制仍不明確。
　　因此本學位論文旨在通過體外培養(yǎng)的人晶狀體上皮細胞模型，探究TNF-α對COX-2的表達調控機制，及COX-2在TNF-α誘導的人晶狀體上皮細胞增殖和轉分化中的作用及其可能的機制。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)的人品狀體上皮細胞（hLEC-B3）分為兩組，即10 ng/ml TNF-α刺激組和無TNF-α刺激的對照組，在

3、刺激后6h、24 h、48 h，用實時定量PCR和 Western Blot檢測COX-2 mRNA和蛋白的表達水平。同時，經TNF-α刺激后24 h，用定量PCR和Western Blot檢測細胞增殖和EMT的標志物細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)和波形蛋白(Vimentin)mRNA及蛋白表達水平，并用Cell Count Kit-8(CCK-8)試劑盒和Transwell遷移小室實驗分別檢測細胞增殖和遷移能力。在光學顯微鏡觀

4、察細胞形態(tài)變化。在TNF-α刺激前加入溴芬酸鈉24 h以阻斷COX-2，然后檢測細胞增殖和EMT的改變。
　　觀察hLEC-B3細胞經10 ng/ml TNF-α刺激時間梯度效應，用Western Blot檢測JNK磷酸化水平的改變以及轉錄因子c-Jun的活化水平，提取細胞核蛋白的檢測和細胞免疫熒光的方法來觀察p-c-Jun的入核情況。預先加入JNK抑制劑SP600125或轉染c-Jun siRNA后檢測COX-2表達的改變，以鑒

5、定JNK信號通路對COX-2表達的調控作用，并利用染色質免疫共沉淀（ChIP）驗證p-c-Jun與COX-2啟動子區(qū)DNA序列的直接相互作用。
　　為進一步探索COX-2可能介導的機制，通過Western Blot及雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)的方法來研究TNF-α對GSK-3β/β-catenin通路以及β-catenin轉錄活性的影響，并通過阻斷COX-2或JNK通路以探究JNK/COX-2在GS K-3β/β-catenin通路活

6、化中的作用。
　　結果：
　　TNF-α可以誘導hLEC-B3細胞COX-2的高表達以及Cyclin D1和Vimentin表達的升高，并促進細胞增殖、遷移和纖維化形態(tài)改變。預先加入溴芬酸鈉阻斷COX-2可以抑制TNF-α誘導的Cyclin D1和Vimentin的高表達及細胞增殖和EMT。TNF-α通過激活JNK/p-c-Jun信號通路調控COX-2的表達，ChIP-qPCR結果顯示p-c-Jun與COX-2啟動子區(qū)DNA

7、序列具有直接相互作用。另外，TNF-α可以激活GSK-3β/β-catenin通路并提高β-catenin轉錄活性。藥物阻斷COX-2或JNK信號通路均可以抑制TNF-α活化的GSK-3β/β-catenin通路和β-catenin轉錄活性。轉染β-catenin siRNA可減弱了溴芬酸鈉對TNF-α誘導的Cyclin D1和Vimentin高表達的抑制效應。
　　結論：
　　TNF-α通過JNK信號轉導通路調控COX-2