大豆遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立及轉(zhuǎn)錄因子ABP9基因的導(dǎo)入研究.pdf

1、大豆是植物蛋白及油脂的重要來源，在我國廣泛種植。通過基因工程的方法對大豆進(jìn)行有目的改良，是一種較常規(guī)育種更為有效、快速的方法，是現(xiàn)代生物技術(shù)在生產(chǎn)實(shí)踐中的具體應(yīng)用。但大豆與其他作物相比，在遺傳轉(zhuǎn)化操作技術(shù)上有一定的困難，主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)化效率低，轉(zhuǎn)化后植株再生頻率低及重復(fù)性差等方面。建立理想、高效的大豆轉(zhuǎn)化體系，是目前的研究熱點(diǎn)之一。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法是植物基因工程中較為常用的方法之一，在利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)中，有許多因

2、素對轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)基因植株的再生都有重要影響，對這些因素進(jìn)行研究具有重要的應(yīng)用價值。 本研究直接以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)為平臺，選擇用于大田生產(chǎn)的栽培大豆中黃13、早熟18、合豐25、黑農(nóng)35、綏農(nóng)14、冀豆12、綏農(nóng)20、鄭92116、科新3號、魯豆4號、中品661和浙春3號的子葉節(jié)為外植體，用EHAl01農(nóng)桿菌菌株(含pPTN289質(zhì)粒)浸染，對大豆子葉節(jié)經(jīng)器官發(fā)生途徑誘導(dǎo)叢生芽的幾個重要影響因素進(jìn)行了研究，同時對與農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化大豆

3、頻率有關(guān)的影響因子進(jìn)行了優(yōu)化，改善了轉(zhuǎn)化條件，提高了轉(zhuǎn)化率，建立了一種轉(zhuǎn)化效率較高、穩(wěn)定性好、通用性強(qiáng)的大豆轉(zhuǎn)化技術(shù)體系。然后以EHAl05農(nóng)桿菌菌株(含pCRI20-IND-ABP9質(zhì)粒)浸染，將目的基因ABP9導(dǎo)入大豆進(jìn)行研究，獲得再生植株。 獲得的主要結(jié)果如下： 1.用EHAl01農(nóng)桿菌菌株(含pPTN289質(zhì)粒)浸染，用基本培養(yǎng)基培養(yǎng)12個不同基因型大豆的子葉節(jié)，它們的再生轉(zhuǎn)化率在18.6﹪～59.32﹪之間。從

4、中篩選出早熟18、合豐25、黑農(nóng)35三個再生和轉(zhuǎn)化頻率較高(49.12﹪、52.13﹪、59.3﹪)的基因型；同時它們是對農(nóng)桿菌敏感的大豆基因型，表明再生率和轉(zhuǎn)化效率高的基因型對農(nóng)桿菌敏感性強(qiáng)的基因型具有一致性。 2.共培養(yǎng)轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化。用不同培養(yǎng)基對早熟18和黑農(nóng)35進(jìn)行共培養(yǎng)，經(jīng)過gus瞬時表達(dá)檢測，結(jié)果表明：B5基本培養(yǎng)基+6-BAl.67mg/1+Agar瓊脂和B5基本培養(yǎng)基+6-BAl.67mg/l+Agrose瓊脂

5、粉的培養(yǎng)基為理想的培養(yǎng)基；葡萄糖和谷氨酰胺對誘導(dǎo)叢生芽具有抑制作用。 3.在誘導(dǎo)叢生芽階段，對早熟18進(jìn)行不同梯度的pH值試驗(yàn)，結(jié)果表明，pH值在5.7時，誘導(dǎo)的叢生芽最多，褐化和黃化的程度最輕，是最適pH值。 4.不同激素的配比使用對早熟18再生苗生根的影響。結(jié)果表明MS培養(yǎng)基+IBA(1.0mg/l)能提高早熟18再生苗的生根效率，可達(dá)到93.3﹪，同時縮短再生苗生根的啟動時間。 5.對獲得的經(jīng)過EHA101