HSV-IUS1基因缺失重組病毒和UL35熒光標(biāo)記重組病毒的構(gòu)建.pdf

1、皰疹病毒具有較高的人群感染率,尤以Ⅰ型單純皰疹病毒(Herpes simplex virus typeⅠ,HSVI)的感染最為常見,由于該病毒具有潛伏感染的特性,所以當(dāng)感染HSVI病毒后,雖然能引起機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,但并不能將病毒徹底清除,病毒在宿主的三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞或周圍星形神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中潛伏,在某些因素的影響下,病毒可再次激活而增殖,引發(fā)角膜炎、腦炎等多種癥狀。
　　 Ⅰ型單純皰疹病毒的基因表達(dá)具有嚴(yán)格的時(shí)序性,按其表達(dá)先后順

2、序可以將病毒的基因分為立即早期基因(α)、早期基因(β)和晚期基因(γ)3類,前一期的基因表達(dá)為后一期基因表達(dá)所必需。
　　 本課題前期工作對(duì)α基因編碼的5種立即早期蛋白之一的ICP22和γ基因編碼的7種核衣殼蛋白之一的VP26進(jìn)行了研究。對(duì)ICP22的研究發(fā)現(xiàn),該蛋白不但對(duì)病毒的早期基因和晚期基因有調(diào)節(jié)作用,而且對(duì)自身基因和細(xì)胞基因有轉(zhuǎn)錄抑制的效果,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)VP16與其相互作用能解除這種抑制作用,這樣的研究結(jié)果有助對(duì)病毒級(jí)聯(lián)

3、反應(yīng)和潛伏感染的特性做深入的解釋；對(duì)VP26的研究發(fā)現(xiàn),該蛋白和病毒的出細(xì)胞膜有著直接的關(guān)系,并通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩查到VP26和細(xì)胞膜上的蛋白CMTP-7有相互作用,推測(cè)VP26蛋白通過和CMTP-7的相互作用,觸發(fā)了HSVI包膜化的進(jìn)程,并且在完成HSVI的包膜化的同時(shí)進(jìn)行有效出胞過程。這些研究雖然給我們認(rèn)識(shí)HSVI提供了一些新的線索和思路,但前期工作只是建立在基因水平上的研究,無法確定目的蛋白在病毒中的作用以及與其相互作用的其它蛋

4、白及相互作用。因此,進(jìn)一步研究在病毒水平上ICP22蛋白的作用,ICP22蛋白的缺失對(duì)病毒的感染復(fù)制是否有較大的影響,VP26蛋白是否與病毒的出入胞膜過程有很大的關(guān)系,同時(shí)也為了能定位VP26蛋白在不同時(shí)期細(xì)胞內(nèi)外的表達(dá)情況。只有通過構(gòu)建重組病毒的手段,在病毒水平上對(duì)以上兩個(gè)蛋白進(jìn)行研究。
　　 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)研究目的不同利用同源重組的方法構(gòu)建了ICP22缺失和VP26示蹤的重組病毒,為了研究ICP22蛋白缺失是否影響病毒的感染復(fù)制

5、以及ICP22蛋白在病毒水平上功能,利用同源重組方法用綠色熒光蛋白(GFP)的編碼基因取代ICP22蛋白的編碼基因。利用流式細(xì)胞儀分選結(jié)合蝕斑篩選的方法得到ICP22蛋白缺失的單克隆重組病毒,利用蝕斑直接篩選得到用GFP示蹤VP26蛋白的單克隆重組病毒。對(duì)ICP22蛋白缺失重組病毒進(jìn)行綠色熒光的表達(dá)情況的鏡下觀察、GFP基因序列的測(cè)定、重組病毒中GFP基因的定量PCR檢測(cè)、GFP蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)等方法進(jìn)行了驗(yàn)證,成

6、功構(gòu)建了ICP22蛋白缺失的重組病毒,并在研究過程中發(fā)現(xiàn)ICP22蛋白缺失的重組病毒出現(xiàn)感染復(fù)制停滯的現(xiàn)象,在充分說明ICP22蛋白在細(xì)胞中具有重要的功能的同時(shí)也提示,能否利用重組病毒的嗜神經(jīng)特性和病毒復(fù)制感染的停滯性,提供一種安全的遞送外源基因的病毒載體,用于治療神經(jīng)系統(tǒng)的疾病。
　　 為了驗(yàn)證VP26蛋白在病毒水平與出細(xì)胞膜之間的關(guān)系,將綠色熒光蛋白(GFP)的編碼基因插入VP26蛋白編碼基因的起始密碼子后,利用熒光的表達(dá)可

7、以檢測(cè)VP26蛋白在病毒感染進(jìn)程中不同時(shí)段在細(xì)胞內(nèi)的定位。顯微鏡下觀察VP26蛋白示蹤的重組病毒熒光表達(dá)情況、GFP基因序列的測(cè)定等方法進(jìn)行了驗(yàn)證,成功構(gòu)建了VP26蛋白示蹤的重組病毒,可以利用綠色熒光的表達(dá)時(shí)時(shí)觀測(cè)VP26蛋白在細(xì)胞中的定位以及研究該蛋白與病毒出入胞膜之間的關(guān)系,
　　 綜上所述,重組病毒有助于在病毒水平研究目的蛋白的相關(guān)功能,ICP22蛋白缺失的重組病毒和VP26蛋白示蹤重組病毒的成功構(gòu)建,對(duì)于在病毒水平研究