重組DEV gH與UL24基因桿狀病毒構(gòu)建及gH與UL24蛋白細(xì)胞定位.pdf

1、本文對(duì)重組DEV gH與UL24基因桿狀病毒構(gòu)建及gH與UL24蛋白細(xì)胞定位進(jìn)行了研究。主要內(nèi)容如下： 1.重組DEVgH與UL24基因桿狀病毒的構(gòu)建：根據(jù)己發(fā)表的DEVgH與UL24基因序列，設(shè)計(jì)引物p1/p2、p3/p4與p5/p6并以DEV核酸為模板克隆gH(2505bp)與UL24(1230bp)基因。其中將gH基因分為互相重疊的兩個(gè)片段gH1與gH2，用引物p1/p2擴(kuò)增gH1基因并將該基因連接pMD18-T載體構(gòu)建克

2、隆載體pMD18-T-gH1；引物p3/p4擴(kuò)增gH2基因。用Xho Ⅰ與SfcⅠ雙酶切pMD18-T-gH1，SfcⅠ與Kpn Ⅰ雙酶切g(shù)H2，最后將這兩段酶切產(chǎn)物與DBlueBacHis2A連接，成功構(gòu)建了重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pBlue-gH。用p5/p6擴(kuò)增UL24基因并將該基因連接pMD18-T載體構(gòu)建克隆載體pMD18-T-UL24，用Xho Ⅰ與EcoR Ⅰ雙酶切DMD18-T-UL24，將酶切產(chǎn)物與pBlueBacHis2

3、A連接，構(gòu)建重組桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體DBlHe-UL24。分別將鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒純化，與線性化的桿狀病毒共轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，經(jīng)3輪蝕斑篩選，獲得了純化的重組桿狀病毒。 2.gH蛋白細(xì)胞定位：將gH基因擴(kuò)增產(chǎn)物連接pMD18-T構(gòu)建克隆載體pMD18-T-gH，并與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)分別用HindⅢ與EcoR Ⅰ雙酶切，構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pcDNA-gH。將純化的陽(yáng)性重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，并用該純化

4、質(zhì)粒免疫BALB/c鼠以制備抗gH蛋白血清。間接免疫熒光試驗(yàn)表明，實(shí)現(xiàn)了DEVgH蛋白在體外的瞬時(shí)表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于細(xì)胞外膜。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，gH基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果出現(xiàn)目的條帶，進(jìn)一步證明了gH蛋白在體外的表達(dá)。 3.UL24蛋白細(xì)胞定位：根據(jù)己發(fā)表的UL24基因序列，設(shè)計(jì)引物p7/p8以DEV核酸為模板進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的目的基因亞克隆至pEGFP-C1載體中，構(gòu)建重組表