缺失v-cath基因的棉鈴蟲單核衣殼核型多角體重組病毒的構(gòu)建.pdf

1、桿狀病毒是一類雙鏈環(huán)狀DNA病毒，作為生物防治殺蟲劑及高效外源蛋白表達(dá)載體得到了廣泛研究，其分子生物學(xué)和侵染機(jī)制的研究也取得了很大進(jìn)展。桿狀病毒基礎(chǔ)理論的研究不僅有助于對病毒自身的了解，而且為更好的利用桿狀病毒提供了可能。桿狀病毒的基因中含有很多非必需基因，其中桿狀病毒的組織蛋白酶基因(v-cath，viralcathepsin)就是桿狀病毒病毒復(fù)制的一類晚期非必需基因。 V-cath基因，又稱半胱氨酸蛋白酶基因cp，自1992

2、年Rawling在AcMNPV中發(fā)現(xiàn)此基因以來，人們對v-cath基因的結(jié)構(gòu)及其蛋白已有了較為深入的研究，對v-cath的功能有了初步的探討。 昆蟲被桿狀病毒感染后會發(fā)生液化現(xiàn)象，這有利于病毒向周圍環(huán)境中擴(kuò)散。缺失v-cath的AcMNPV病毒感染昆蟲后，不能導(dǎo)致宿主的液化，顯示v-cath與宿主的液化即組織的降解有著直接的聯(lián)系。V-CATH蛋白能夠特異性地降解細(xì)胞的肌動蛋白，這可能直接導(dǎo)致了細(xì)胞骨架的崩潰和宿主昆蟲的液化死亡。

3、 HaSNPV是從自然界發(fā)病的棉鈴蟲中分離得到的單核衣殼核多角體病毒，HaSNPV的v-cath基因的編碼區(qū)長1098bp，預(yù)計編碼一個366個氨基酸的蛋白產(chǎn)物。HaSNPV的V-CATH蛋白與其他桿狀病毒的同源蛋白具有相似的保守結(jié)構(gòu)并保留有相同的酶活性位點(diǎn)，根據(jù)已知的桿狀病毒組織蛋白酶序列構(gòu)建了v-cath基因的進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)HaSNPV的v-cath位于NPV組中一個單獨(dú)的分支，結(jié)合v-cath基因在棉鈴蟲病毒基因組中的位置與

4、其他NPV有較大不同，推測HaSNPV的v-cath基因可能擁有特殊的進(jìn)化歷程。本文通過構(gòu)建缺失v-cath基因的HaSNPV重組病毒，為研究HaSNPV的v-cath的功能奠定了基礎(chǔ)。 我們在HaSNPV的v-cath基因序列的上游和下游分別取一段約為600bp左右的DNA片段作為上游同源交換臂和下游同源交換臂，設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增，將這兩個DNA片段分別克隆到質(zhì)粒pBluescriptKS-上，然后將帶有hsp70真核啟動子