棉鈴蟲單核衣殼核型多角體病毒(HaSNPV)Orf99基因的初步研究.pdf

1、棉鈴蟲單核衣殼核型多角體病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsidnucleopolyhedrovirus，HaSNPV)是一類雙鏈環(huán)狀DNA 病毒，其分子生物學(xué)和基因功能研究已取得很大進(jìn)展。開放閱讀框99（open reading frame 99，orf99）是HaSNPV的一個(gè)功能未知的特有基因，本文首次對(duì)HaSNPV G4株基因組中的orf99基因進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道。
　　

2、Orf99基因和Ha99 蛋白序列通過生物信息學(xué)分析表明：orf99基因長為357bp，預(yù)計(jì)編碼118個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子大小為14．5KDa；orf99基因起始密碼子上游-62位和-49位分別存在早期啟動(dòng)子信號(hào)序列“CAGT ”和“TATA ”；
　　 該基因無信號(hào)肽，無跨膜結(jié)構(gòu)；由SMART 分析該蛋白存在鐵蛋白類似結(jié)構(gòu)和氧化還原酶活性; 通過PSI-BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，orf99 僅與美洲棉鈴蟲HzSNPV orf1

3、02同源性高達(dá)99％，另外由PHYLOGENETIC TREE 分析得知orf99在Helicoverpaarmigera nucleopolyhedrovirus、 Helicoverpa armigera NPV、 Helicoverpaarmigera NPV NNg1、Helicoverpa zea SNPV 中比較保守，遺傳距離比較近，推測(cè)他們可能是從同一祖先分支進(jìn)化的。
　　 本試驗(yàn)中，我們用表達(dá)載體pGEX-KG

4、及表達(dá)宿主大腸桿菌BL21 對(duì)orf99基因進(jìn)行谷胱甘肽（GST）融合表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物約為40kDa，與預(yù)期的大小相符。
　　 另外,我們成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pIZ/V5-His-egfp-orf99,該載體利用熒光蛋白基因egfp 作為報(bào)告基因，將orf99和egfp 連接在pIZ/V5-His 上，形成融合表達(dá)產(chǎn)物的載體,為進(jìn)行細(xì)胞定位做了準(zhǔn)備.
　　 為研究orf99基因的功能，我們首先設(shè)計(jì)一對(duì)200bp 左右，含