棉鈴蟲單核衣殼核型多角體病毒(HaSNPV)orf109性質(zhì)的初步研究.pdf

1、棉鈴蟲單核衣殼核型多角體病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HaSNPV)是一類雙鏈環(huán)狀DNA病毒,其分子生物學(xué)和基因功能研究已取得很大進展。開放閱讀框109(open reading frame109,orf109)是HaSNPV的一個功能未知基因,本文首次對HaSNPV G4株基因組中的orf109進行研究報道。
　　 orf109基

2、因及其編碼蛋白HA109的序列經(jīng)過生物信息學(xué)軟件分析后顯示:orf109全長357bp,編碼118個氨基酸組成的肽鏈,預(yù)測蛋白質(zhì)分子量大小為13.6kDa；orf109起始密碼子上游-235位和-238位均存在早期啟動子特征序列CAGT,TATAA,表明orf109可能是一個早期表達基因。Ha109是HaSNPV G4株特有的一個未知功能基因,由于其具有核輸出信號,推測該基因很可能在宿主細胞核物質(zhì)及能量運輸,信號傳遞等方面起著特定作用:

3、通過同源核酸及蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)只與同種美洲棉鈴蟲HzSNPV orf112有99％以上同源性,僅具有幾個核苷酸差異,但并不影響所編碼的蛋白質(zhì)的序列,因此核酸序列的差異反映了進化上的不同:orf109很可能是病毒在進化過程中不斷重組和重排產(chǎn)生的新基因,但具體機理還不清楚。所以Ha109基因功能的研究對于闡明該基因的獨特性及進化史具有重要意義。
　　 本試驗中,我們利用表達載體pGEX—KG將orf109編碼蛋白與谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(

4、GST)在表達宿主大腸桿菌BL21中融合表達,表達產(chǎn)物約為38.5KDa,與預(yù)期的大小相符。表達蛋白經(jīng)初步純化(包涵體純化和凝膠電泳分離相結(jié)合),免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體。經(jīng) western-blot檢測,獲得了特異性較強的抗體,為進一步研究HA109蛋白的表達時相及其在病毒顆粒上的定位打下了基礎(chǔ)。同時,我們也探索了GST—HA109融合蛋白的可溶性表達條件,我們發(fā)現(xiàn)融合蛋白主要以包涵體形式表達,在我們所嘗試的任何條件下可溶性融合

5、蛋白表達量都很低。
　　 為研究orf109的功能,我們通過同源重組在原核水平將該基因orf109敲除,構(gòu)建orf109基因缺失型重組病毒。首先我們通過構(gòu)建克隆的方法在pKS—egfp—Cmr質(zhì)粒 Phap70-egfp—SV40-Cmr兩端分別加上orf109的上下游同源臂,然后酶切回收帶有同源臂的ha109UP—Phap70-egfp-Cmr-ha1009D0線性片段,借助編碼λ噬菌體 Red—ET線性重組酶系統(tǒng)的質(zhì)粒pKD

6、46及棉鈴蟲桿狀病毒細菌人工染色體HaBacHz8,在大腸桿菌BW25113中進行同源重組。通過PCR及酶切鑒定,我們得到了orf109缺失型重組病毒HaBacΔ109。
　　 為系統(tǒng)分析orf109在病毒復(fù)制周期中的作用,我們利用Bac—to—Bac系統(tǒng)構(gòu)建了帶有綠色熒光蛋白egfp基因和多角體編碼基因polyhedrin的四種基因型重組病毒:orf109缺失型重組病毒HaBacK0,orf109單回復(fù)型重組病毒HaBacSi