馬索羅酚的丹參酮ⅡA對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抗氧化應(yīng)激作用.pdf

1、目的:多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是一種主要病理特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘的自身免疫疾病，好發(fā)病于中青年人，多發(fā)于女性。由于患者常遺留神經(jīng)功能缺損，造成生活工作上的不便，甚至喪失工作能力，給個人、家庭和社會帶來巨大的損失，因此科研工作者一直在尋找有效的治療藥物。本實驗利用實驗性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠來進(jìn)行研究，大多

2、數(shù)研究人類多發(fā)性硬化的學(xué)者都認(rèn)為EAE是理想的動物模型，已有研究證實萊菔硫烷對EAE小鼠有神經(jīng)保護作用，這種保護作用可能是通過激活了Nrf2/ARE通路，使機體對氧化應(yīng)激的抵抗能力增強。但萊菔硫烷不能應(yīng)用于人體，我們查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)甲二氫愈創(chuàng)木酸、又稱為馬索羅酚(Nordihydroguaiaretic acid，NDGA)和丹參酮ⅡA(TanshinoneⅡA)這兩種Nrf2/ARE通路的激活劑，其中馬索羅酚以往曾作為食物的防腐添加劑使用

3、，丹參酮ⅡA是已在臨床使用的藥物，將這兩種藥物作為實驗干預(yù)藥物，為臨床用藥進(jìn)行初步篩選。與以往實驗在造模當(dāng)天即給予干預(yù)藥物不同，本實驗?zāi)M患者“發(fā)病-就診-治療”的診治過程，在小鼠出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀后才給予干預(yù)藥物，更具有臨床實踐意義。本實驗研究了馬索羅酚和丹參酮ⅡA對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的神經(jīng)保護作用，以及這種保護作用的作用機制，從個體、細(xì)胞、分子角度初步探討這兩種藥物應(yīng)用于多發(fā)性硬化的臨床治療的可能性，從而為臨床治療提供新

4、的思路，初步篩選藥物。
　　方法:
　　1.分組:入選的小鼠為健康雌性C57BL/6小鼠、8-10周齡、體重為18-20g，共27只小鼠，將其隨機分為DMSO組、NDGA組、丹參酮ⅡA組，每組各9只。
　　2.制備EAE小鼠模型所使用的藥物:使用無菌的生理鹽水將MOG35-55稀釋成5mg/ml，加入等體積弗氏完全佐劑，使其比例為1∶1，從而使結(jié)核桿菌的最終濃度為4mg/ml充分乳化。使用乙醚麻醉后固定小鼠，在小鼠脊柱

5、旁雙側(cè)分四點進(jìn)行皮下注射乳化混合物各0.025ml，每只小鼠共0.1ml，于免疫當(dāng)天（第0小時）腹腔注射500ng PTX及第二天（第48小時）再次腹腔注射等量PTX，每只小鼠共1000ngPTX。
　　3.干預(yù)處理:小鼠自發(fā)?。ㄔu分≥1分）當(dāng)天，DMSO組每只每日腹腔注射5％DMSO1ml/mg(5％二甲基亞砜即DMSO是配置NDGA及丹參酮ⅡA溶液的溶劑)，NDGA組每只每日腹腔注射NDGA溶液10mg/kg，丹參酮ⅡA組每只

6、每日腹腔注射丹參酮ⅡA溶液20mg/kg。
　　4.神經(jīng)系統(tǒng)功能評分:由兩名觀察者選用雙盲法，逐日早8:00和晚16:00兩次，對各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。至DMSO組、NDGA組、丹參酮ⅡA組小鼠發(fā)病后20天。神經(jīng)功能評分選用Weaver's(15)評分標(biāo)準(zhǔn)，該標(biāo)準(zhǔn)較5分法及7分法更為細(xì)致。
　　5.腦組織MDA含量測定:按照每只小鼠處死的時間，斷頸處死小鼠，在冰盤上取出腦組織，迅速剝除硬腦膜，在冰盤上將腦組織分為額極、腦

7、室周和小腦三部分，選取腦室周圍腦組織，用4攝氏度生理鹽水洗去血液，濾紙吸干，稱取重量，按照1∶9的比例加入4攝氏度生理鹽水，超聲勻漿，設(shè)定2000r/min，在4攝氏度下，共離心15分鐘，抽取上清液，置于-80攝氏度保存，待測。測量時嚴(yán)格按照丙二醛試劑盒說明書操作。
　　6.腦組織表達(dá)Nrf2、HO-1含量測定:按照每只小鼠處死的時間，水合氯醛麻醉后，固定小鼠，進(jìn)行左心室穿刺，使用生理鹽水灌出血液，使用4％多聚甲醛固定組織，固定2

8、小時后取腦組織。將腦組織浸泡在多聚甲醛中為充分固定腦組織，將腦組織在多聚甲醛中浸泡24小時，行石蠟包埋，以5um厚度切取組織切片，進(jìn)行免疫組化染色，之后使用光學(xué)顯微鏡觀察陽性細(xì)胞，并計數(shù)。
　　結(jié)果:
　　1.臨床表現(xiàn):
　　神經(jīng)功能評分:DMSO組、NDGA組、丹參酮ⅡA組分別為2.50±0.40、1.25±0.29、1.33±0.19，NDGA組及丹參酮ⅡA組與DMSO組對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

9、r>　　2.腦組織中MDA含量:DMSO組、NDGA組、丹參酮ⅡA組在發(fā)病20天時含量分別為41.05±8.23、23.28±3.02、27.03±3.51(單位為nmol/mgprot)，NDGA組及丹參酮ⅡA組與DMSO組對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.腦組織中Nrf2表達(dá)量:DMSO組、NDGA組、丹參酮ⅡA組在發(fā)病20天時Nrf2陽性細(xì)胞計數(shù)分別為19.13±2.81、84.41±3.48、76.15±3

10、.18（單位為個/高倍視野），NDGA組及丹參酮ⅡA組與DMSO組對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.腦組織中HO-1表達(dá)量:DMSO組、NDGA組、丹參酮ⅡA組在發(fā)病20天時HO-1陽性細(xì)胞計數(shù)分別為21.46±2.86、86.04±11.22、83.00±8.76（單位為個/高倍視野），NDGA組及丹參酮ⅡA組與DMSO組對比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.NDGA和丹參酮Ⅱ