中樞神經(jīng)系統(tǒng)來源的IL-33在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎中的作用.pdf

1、背景：
　　IL-1家族的新成員白介素-33（Interleukin-33，IL-33）既可作為核因子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制的作用，又具有細(xì)胞因子的信息傳遞功能。除了在細(xì)胞受損時(shí)被動(dòng)釋放至胞外，IL-33能否主動(dòng)釋放目前尚不清楚。IL-33在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）的多種細(xì)胞核內(nèi)組成性高表達(dá)，被證明與 CNS最常見的自身免疫性疾病多發(fā)性硬化癥/實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（Multiple scler

2、osis/ Experimental autoimmune encephalomyelitis，MS/EAE）具有相關(guān)性，但 CNS中的IL-33的釋放特征及其對(duì)MS/EAE疾病進(jìn)展的作用遠(yuǎn)未闡明。
　　目的：
　　闡明EAE病程中CNS中的IL-33的釋放特征及對(duì)EAE疾病進(jìn)展的作用，為探討IL-33可能的生理學(xué)和病理學(xué)意義提供依據(jù)，并為治療MS提供新的生物學(xué)靶標(biāo)。
　　方法：
　　一、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
　　1．

3、用 C57BL/6小鼠制備 EAE動(dòng)物模型，根據(jù) EAE的臨床癥狀和疾病的發(fā)展趨勢(shì)將EAE病程分為發(fā)病前期（Pre-onset）、初期（Onset）、高峰期（Peak）和慢性期（Chronic）四期，以正常的、未經(jīng)任何處理（Naive）的C57BL/6小鼠為對(duì)照。在EAE病程的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取材并進(jìn)行以下檢測(cè)：
　　（1）EAE各期脊髓組織中IL-33的表達(dá)變化：Western Blot檢測(cè)總蛋白水平，免疫組化檢測(cè)胞內(nèi)蛋白的水平，EL

4、ISA檢測(cè)脊髓組織勻漿液、釋放到腦脊液（Cerebrospinal fluid，CSF）和血清中的水平，ELISA同時(shí)還檢測(cè)可溶性ST2（sST2）以及IL-1β、IL-17A和TNF-α等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平的變化。
　　（2）脊髓組織中IL-33及ST2的細(xì)胞定位：免疫熒光染色檢測(cè)Naive小鼠脊髓組織切片中IL-33、ST2與星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP標(biāo)記）、小膠質(zhì)細(xì)胞（CD11b標(biāo)記）以及神經(jīng)元（NeuN標(biāo)記）的共定位情況，并

5、檢測(cè)EAE各期IL-33和IL-33陽性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的變化。
　　2．利用小鼠腦定位儀將C57BL/6小鼠進(jìn)行側(cè)腦室埋管，放置7天小鼠創(chuàng)傷愈合后再進(jìn)行EAE造模，并于造模后的第10~20天從埋入側(cè)腦室的導(dǎo)管給予IL-33 mAb處理，2μg/次/只，隔天給藥。以同型抗體IgG2a和PBS組為對(duì)照。同時(shí)對(duì)小鼠EAE發(fā)病的臨床癥狀進(jìn)行評(píng)分，并于EAE高峰期（造模后第19天）取材進(jìn)行以下檢測(cè)：
　?。?）檢驗(yàn)IL-33 mAb中

6、和IL-33的效果：Western Blot檢測(cè)脊髓組織中IL-33的總蛋白水平，組化檢測(cè)脊髓切片中胞內(nèi) IL-33的水平，ELISA檢測(cè)脊髓組織勻漿液的IL-33、sST2的水平。
　?。?）檢驗(yàn)IL-33 mAb處理對(duì)CNS的影響：LFB染色檢測(cè)脊髓髓鞘脫失情況，免疫組化染色檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP標(biāo)記）、小膠質(zhì)細(xì)胞（CD11b標(biāo)記）的增殖活化以及神經(jīng)元（NeuN標(biāo)記）的數(shù)量變化；ELISA檢測(cè)脊髓組織勻漿液的TNF-α、H

7、MGB1等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的水平。
　　（3）檢測(cè)IL-33 mAb處理對(duì)T細(xì)胞亞群的影響：脊髓切片CD3免疫組化染色檢測(cè)浸潤(rùn)到 CNS的T淋巴細(xì)胞水平；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)脾臟、腹股溝和腋窩引流淋巴結(jié)Th1/17型細(xì)胞亞群的變化。
　　二、體外實(shí)驗(yàn)
　　1．IL-33在原代CNS細(xì)胞中的表達(dá)：分離培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元，Western Blot分別檢測(cè)IL-33在原代星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元胞漿-胞核蛋白中的表達(dá)。

8、>　　2．IL-33主動(dòng)釋放：
　　（1）培養(yǎng)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，分別用脊髓組織勻漿液（Naive、Pre-onset和Peak期）、TNF-α聯(lián)合 ATP處理細(xì)胞，用超濾管濃縮法將刺激后的培養(yǎng)上清濃縮10倍后，ELISA檢測(cè)IL-33的水平，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞裂解液中IL-33的含量，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞拒染法檢測(cè)細(xì)胞的生存率，GFAP熒光染色檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。
　?。?）培養(yǎng)人星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系 U87細(xì)胞

9、，用免疫熒光染色確定 U87細(xì)胞表達(dá)IL-33后，用PTX和/或ATP處理細(xì)胞，用超濾管濃縮將刺激后的培養(yǎng)上清濃縮10倍后，ELISA檢測(cè)濃縮上清中IL-33的水平，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞拒染法檢測(cè)細(xì)胞的生存率。
　　3．EAE高峰期釋放的IL-33對(duì)膠質(zhì)細(xì)胞功能的調(diào)控：
　　（1）對(duì)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用：用EAE高峰期脊髓組織勻漿液（含有高水平IL-33）處理細(xì)胞，再加入IL-33 mAb中和IL-33，MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖，GF

10、AP熒光染色檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化。
　?。?）對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞系BV2細(xì)胞的作用：用EAE高峰期脊髓組織勻漿液（含有高水平IL-33）處理細(xì)胞，再加入IL-33 mAb中和IL-33，MTT檢測(cè)細(xì)胞的增殖，NO檢測(cè)反映細(xì)胞的活化；熒光微球吞噬實(shí)驗(yàn)檢測(cè)吞噬功能。然后用 LPS模擬炎癥微環(huán)境激活BV2細(xì)胞，再用重組IL-33干預(yù)LPS激活的細(xì)胞并進(jìn)行以上檢測(cè)加以佐證。
　　結(jié)果：
　　1．IL-33在EAE進(jìn)展中被釋放到脊髓

11、組織局部：在Pre-onset、Onset和Peak期脊髓組織胞核內(nèi)IL-33表達(dá)減少，而IL-33總蛋白并未減少，Chronic期胞核內(nèi)IL-33和IL-33總蛋白均顯著增加；ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)脊髓組織勻漿上清從 Pre-onset期開始即有 IL-33釋放，Peak期釋放水平最高；但血清和 CSF中未檢測(cè)到 IL-33；此外，脊髓組織勻漿液中的TNF-α和IL-17A等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的水平也有所增加。
　　2．脊髓組織定居細(xì)

12、胞表達(dá) IL-33和其受體 ST2：在正常小鼠脊髓組織中，IL-33不僅定位在星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞核中，而且還表達(dá)在神經(jīng)元的胞核和胞漿中；提取原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的胞漿-胞核蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè) IL-33進(jìn)一步證實(shí)了這點(diǎn)。ST2主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。
　　3．IL-33釋放的來源：
　?。?）IL-33可能被神經(jīng)元被動(dòng)釋放：在EAE進(jìn)展中，胞內(nèi)IL-33的減少與神經(jīng)元的損傷正相關(guān)。

13、>　　（2）IL-33被星形膠質(zhì)細(xì)胞主動(dòng)釋放：在EAE進(jìn)展中，胞內(nèi)IL-33的減少與星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活負(fù)相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明在炎癥刺激如脊髓組織勻漿液和 ATP能誘導(dǎo)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞活化并主動(dòng)釋放IL-33；TNF-α也能誘導(dǎo)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞活化并主動(dòng)釋放IL-33，而且這種釋放不需依賴ATP；EAE造模試劑PTX和/或ATP刺激也能誘導(dǎo)U87細(xì)胞主動(dòng)釋放IL-33。
　　4．CNS局部給予IL-33 mAb處理加重EAE：E

14、AE發(fā)病期側(cè)腦室給予IL-33 mAb處理，EAE的臨床癥狀、CNS的組織損傷（脫髓鞘）、T淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥加重；同時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞活化增加，而外周 Th1/17細(xì)胞的比例和數(shù)量不受影響。
　　5．EAE高峰期釋放的IL-33調(diào)控膠質(zhì)細(xì)胞的功能：
　?。?）IL-33抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。
　?。?）IL-33抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和活化，同時(shí)促進(jìn)其吞噬功能。
　　結(jié)論：
　　1．在正常小鼠脊

15、髓組織中，IL-33主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元表達(dá)；ST2主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。
　　2．在EAE進(jìn)展中，受損神經(jīng)元可能被動(dòng)釋放IL-33，激活的星形膠質(zhì)細(xì)胞主動(dòng)釋放IL-33到脊髓組織局部，以旁分泌或自分泌的方式發(fā)揮作用。
　　3．CNS局部給予IL-33 mAb處理加重EAE。
　　4．EAE高峰期釋放的IL-33抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖、活化，同時(shí)促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬功能。
　　綜上