實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中IL-27對(duì)CCL5表達(dá)的影響.pdf

1、背景與目的:多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）自身免疫性疾病，炎癥反應(yīng)在其疾病發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用。白細(xì)胞介素-27(Interleukin-27，IL-27)是近年來新發(fā)現(xiàn)的IL-12家族成員之一，主要由激活的抗原遞呈細(xì)胞APC、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞DCs分泌產(chǎn)生。自IL-27被發(fā)現(xiàn)以來，已顯示出在免疫反應(yīng)調(diào)控中的獨(dú)特作用:誘導(dǎo)T

2、h1細(xì)胞的分化，抑制Th2細(xì)胞和Th17細(xì)胞的發(fā)育;在高度Th1細(xì)胞極化時(shí)，IL-27的主要作用是限制Th1型免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，從而保護(hù)機(jī)體免受過度的免疫反應(yīng)的損傷，同時(shí)具有促炎與抗炎的雙重特征。炎癥性趨化因子5(RANTES/CCL5)是T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的炎性趨化因子之一，可以誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附并穿過血腦屏障(Blood-brainbarrier，BBB)進(jìn)入CNS，從而引起一系列的炎癥反應(yīng)和繼發(fā)病變。研究發(fā)現(xiàn)，在緩解-復(fù)發(fā)型MS中

3、，抑制CCL5的表達(dá)可以預(yù)防疾病的復(fù)發(fā)。目前，有很多國(guó)內(nèi)外研究及報(bào)道提示，在自身免疫性炎癥性疾病中，機(jī)體內(nèi)IL-27和CCL5存在一定的相關(guān)性，但目前并無其具體機(jī)制的相關(guān)研究及報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過在體實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎（experimental autoimmune cerebrospinal meningitis，EAE）模型和離體培養(yǎng)腹腔巨噬細(xì)胞探索CCL5在EAE病變進(jìn)程中受IL-27的變化調(diào)控的影響，并探索其機(jī)制，為預(yù)防MS

4、的疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)提供臨床指導(dǎo)。
　　方法:
　　第一部分:將40只健康雌性C57BL/6小鼠用MOG31-55多肽免疫后0d、7d、15d、21d（每組10只），每天測(cè)其體重并觀察老鼠行為學(xué)變化，用蘇木精-伊紅染色法（Hematoxylin-Eosin staining，HE）觀察小鼠CNS中的炎癥情況;用Western bloting(WB)和免疫組織化學(xué)方法測(cè)量IL-27和CCL5在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)。將50只C57BL

5、/6小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、EAE組、IL-27+EAE組、SC144（IL-27受體拮抗劑）+EAE組、PBS（磷酸緩沖液）+EAE組，用WB和PCR方法測(cè)量CCL5的表達(dá)量。
　　第二部分:用3％巰基乙酸鹽（每只1毫升）腹腔注射C57BL/6小鼠3d后，取小鼠腹腔巨噬細(xì)胞。分別對(duì)原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng)，加入脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)炎性刺激因子誘導(dǎo)mCCL5的表達(dá)，加入

6、重組IL-27和SC144進(jìn)行干預(yù)調(diào)控，收取細(xì)胞用realtime PCR測(cè)定CCL5 mRNA的表達(dá)量及半衰期，用WB測(cè)量IFN-γ和NF-κB的蛋白表達(dá);收取細(xì)胞培養(yǎng)液，用ELISA測(cè)定CCL5的表達(dá)量。
　　結(jié)果:
　　1、EAE小鼠最早在免疫后12天開始發(fā)病，大多數(shù)均集中在14～18天發(fā)病，并于2～4天后達(dá)到疾病高峰，在發(fā)病高峰期時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分均數(shù)為2.38±0.52。
　　2、HE染色示正常組小鼠脊髓無明顯炎

7、性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，血管周圍有明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，呈典型“血管袖套樣”改變，且實(shí)質(zhì)內(nèi)亦有明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，浸潤(rùn)的細(xì)胞類型以淋巴細(xì)胞為主，也可見少量膠質(zhì)細(xì)胞。
　　3、在EAE疾病的過程中，EAE小鼠腦白質(zhì)中IL-27的表達(dá)量逐漸增高;而CCL5的表達(dá)量先升高后降低。與EAE模型組和對(duì)照組相比，IL-27干預(yù)組神經(jīng)功能評(píng)分明顯較降低，疾病高峰期相對(duì)延后，CCL5表達(dá)水平明顯受到抑制(P＜0.05);SC144干預(yù)組神經(jīng)

8、功能評(píng)分明顯較高，疾病高峰期相對(duì)提前，CCL5表達(dá)水平明顯升高(P＜0.05)。
　　4、在細(xì)胞水平，與正常對(duì)照組相比，LPS組、LPS+IL-27刺激組、LPS+SC144+IL-27組CCL5的表達(dá)均增多;與LPS刺激組和LPS+SC144+IL-27組比較，LPS+IL-27刺激組CCL5 mRNA表達(dá)明顯下降(P＜0.05)，CCL5mRNA的半衰期縮短(P＜0.05)。
　　5、與正常對(duì)照組相比，LPS組、LPS+

9、IL-27刺激組、LPS+SC144+IL-27組IFN-γ和NF-κB的表達(dá)均增多(P＜0.05);與LPS刺激組和LPS+SC144+IL-27組比較，LPS+IL-27刺激組IFN-γ和NF-κB表達(dá)明顯下降（P＜0.05）。
　　結(jié)論:在小鼠自身免疫性腦脊髓膜炎疾病進(jìn)展期，IL-27加速CCL5mRNA的半衰期，從而在mRNA和蛋白水平抑制CCL5的表達(dá)，并發(fā)揮抗炎作用，其具體機(jī)制至少部分是基于抑制IFN-γ的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。