胸腺五肽治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎大鼠的實驗研究.pdf

1、目的： 多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)樘攸c的自身免疫性疾病。具有反復(fù)發(fā)作，部分患者病情呈進行性加重的特點。由于MS發(fā)病率較高，呈慢性病程且傾向于青年人罹患，使其成為重要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。MS發(fā)病機制不確切，尚缺乏行之有效的防治措施，因此通過建立動物模型，探討MS的發(fā)病機制，尋求有效的治療方案，是我們目前研究的主要方向

2、。 胸腺五肽(Thymopoietin，TP-5)是從胸腺激素中分離出來的胸腺生成素Ⅱ功能活性部分，胸腺生成素Ⅱ由49個氨基酸組成，而其中由5個氨基酸組成的肽鏈片段，有著與胸腺生成素Ⅱ相同的全部生理功能，所以就把這個五肽片段稱為胸腺五肽。在實驗研究和臨床應(yīng)用中，胸腺五肽均顯示出具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的作用，能誘導(dǎo)T淋巴細胞及其亞群分化和成熟；減少自身抗體的產(chǎn)生；調(diào)節(jié)T淋巴亞群比例，使CD4+/CD8+趨于正常，免疫系統(tǒng)恢復(fù)正常。在某些

3、自身免疫性疾病(如類風濕性關(guān)節(jié)炎，系統(tǒng)性紅斑狼瘡等)中療效明顯，長期應(yīng)用耐受良好。但目前國內(nèi)外應(yīng)用胸腺五肽治療EAE/MS尚未見報道。 本實驗旨在MS的經(jīng)典動物模型-實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)基礎(chǔ)上，探討不同劑量的胸腺五肽對EAE的治療作用及其機制，為脫髓鞘疾病的研究提供新的思路。方法： 1.動物分組：將78只6～8周齡雌性Wis

4、tar大鼠，體重180～200 g，隨機分為正常對照組6只，EAE模型組、地塞米松(dexamethasone，DXM)組、TP-5小劑量組(0.05 mg·kg-1·d-1)、TP-5大劑量組(0.25 mg·kg-1·d-1)各18 R。每組又隨機分為7天、14天、21天三個亞組，每亞組6只大鼠。 2.模型制備：將新鮮豚鼠全脊髓制成勻漿，加上完全福氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)，佐劑中

5、含卡介苗4 mg/mL，經(jīng)過乳化后經(jīng)按0.4 mL/只分別于大鼠四肢足墊皮下注射。藥物治療組于模型制備第一天起給予相應(yīng)劑量腹腔注射，藥物每天一次持續(xù)給至動物處死時為止。 3.神經(jīng)功能評分：于免疫誘導(dǎo)當日及免疫后每天對動物的體重變化、精神狀態(tài)、活動情況進行觀察，并對動物進行神經(jīng)功能評分，采用Kono等提出的標準，分為5分：1分動物尾部無力；2分尾部無力+肢體無力；3分肢體輕度麻痹；4分級肢體嚴重麻痹，被動翻身后不能復(fù)原；5分瀕死狀

6、態(tài)。 4 組織病理學：分別于免疫后第7天、14天、21天，在動物麻醉狀態(tài)下，快速取其大腦側(cè)腦室周圍及頸、胸、腰膨大處組織，40 g/L多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，行HE染色，光學纖維鏡下觀察炎癥細胞浸潤情況。 5 RT-PCR法檢測腦組織IFN-γ、IL-4 mRNA的表達：實驗動物于免疫后第7天、14天、21天，在麻醉狀態(tài)下，快速取大腦側(cè)腦室周圍及頸、胸、腰膨大處組織，液氮中保存,Trizol一步法提取CNS組織總RN

7、A，采用隨機引物法進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，擴增獲得目的基因IFN-γ、IL-4 RT-PCR產(chǎn)物，以β-actin作為內(nèi)對照。最后紫外凝膠成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。結(jié)果： 1.動物發(fā)病率觀察：TP-5小劑量組、DXM組低于EAE組及TP-5大劑量組，均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。DXM組低于TP-5小劑量組，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。EAE組與TP-5大劑量組之間的發(fā)病率沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 2.行為學觀察2.1

8、大鼠在發(fā)病潛伏期和緩解期時神經(jīng)功能評分比較：各組之間無明顯差別。 2.2各組大鼠在發(fā)病高峰期時神經(jīng)功能評分比較：TP-5小劑量組、DXM組各大鼠神經(jīng)功能評分明顯低于EAE組及TP-5大劑量組(P＜0.01)。DXM組明顯低于TP-5小劑量組(P＜0.01)。EAE組與TP-5大劑量組之間神經(jīng)功能評分無明顯差別(P＞0.05)。 3.組織病理學觀察：在疾病早期，EAE鼠組織內(nèi)即出現(xiàn)炎性細胞浸潤，且炎性細胞數(shù)目的多少與疾病嚴

9、重程度相一致。在發(fā)病高峰期和恢復(fù)期，TP-5小劑量組、DXM組炎癥細胞浸潤形成的血管套袖數(shù)目明顯低于EAE組及TP-5大劑量組(P＜0.01)。DXM組和TP-5小劑量組，EAE組和TP-5大劑量組炎癥細胞浸潤形成的血管套袖數(shù)目沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 4 IFN-γ mRNA、IL94 mRNA表達4.1 IFN-γ mRNA：除正常對照組外，其余各組IFN-γ mRNA在潛伏期即表達上調(diào)，隨著進入癥狀高峰期，IFN-

10、γ mRNA表達水平亦達高峰，恢復(fù)期IFN-γ mRNA表達水平下降。在發(fā)病高峰期和恢復(fù)期，DXM組和TP-5小劑量組IFN-γ mRNA表達水平與EAE組及TP-5大劑量組相比明顯下降(P＜0.01)。DXM組與TP-5小劑量組間，EAE組和TP-5大劑量組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 4.2 IL-4 mRNA：IL-4 mRNA表達水平呈逐漸升高的趨勢，潛伏期和癥狀高峰期IL-4 mRNA有所表達，恢復(fù)期達峰值。在發(fā)

11、病高峰期和恢復(fù)期，DXM組和TP-5小劑量組IL-4mRNA表達明顯高于EAE組(P＜0.01)，DXM組與TP-5小劑量組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 結(jié)論： 1.胸腺五肽可以降低EAE大鼠的發(fā)病率，減少疾病對機體的神經(jīng)功能損害。 2.胸腺五肽可以減少EAE大鼠腦組織IFN-γ mRNA的表達，減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)炎癥細胞浸潤的程度。 3.胸腺五肽可以提高EAE大鼠腦組織IL-4 mRNA表達