血管活性腸肽對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身腦脊髓炎大鼠防治作用的研究.pdf

1、目的:探討血管活性腸肽(vocativeintestinalpeptide，VIP)對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimentalallergicencephalomyelitis，EAE）大鼠的防治作用及其免疫學(xué)機(jī)制，為VIP治療多發(fā)性硬化(multiplesclerosis，MS)尋找理論依據(jù)。
　　方法:通過(guò)隨機(jī)雙盲法，將60只雌性Wistar大鼠（200g-250g/只）分成4組，每組各15只:正常對(duì)照組、EAE對(duì)照

2、組、VIP低劑量防治組和VIP高劑量防治組。將粗制髓鞘堿性蛋白(myelinbasicprotein，MBP)+完全福氏佐劑(completefreud'sadjuvant，CFA)注入EAE對(duì)照組及VIP低、高劑量防治組大鼠雙側(cè)后肢足掌皮下(0.2ml/100g)進(jìn)行主動(dòng)免疫，正常對(duì)照組給予等量生理鹽水+CFA，免疫后0小時(shí)及48小時(shí)分別給各組大鼠腹腔注射百日咳素(pertussistoxin，PTX)（0.2ml/只）建立EAE模型

3、。自造模當(dāng)日起，VIP低、高劑量防治組每隔一日分別腹腔注射VIP4nmol/kg(0.2ml)、16nmol/kg(0.8ml)，正常對(duì)照組及EAE對(duì)照組每隔一日腹腔注射0.8ml生理鹽水，連續(xù)10天。將連續(xù)3天癥狀評(píng)分無(wú)加重、四肢癱瘓或死亡作為各組大鼠發(fā)病高峰期，在發(fā)病高峰期處死大鼠，未發(fā)病大鼠觀察8周后處死。保留大鼠下腔靜脈血、腦脊髓組織及脾臟。
　　1.記錄發(fā)病大鼠潛伏期、進(jìn)展期和高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分變化。
　　2.

4、觀察各組發(fā)病大鼠腦脊髓組織基本病理改變。
　　3.通過(guò)免疫組織化學(xué)法，采用抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體(GFAP)檢測(cè)各組大鼠腦組織內(nèi)的星型膠質(zhì)細(xì)胞活化情況;用髓鞘堿性蛋白(MBP)抗體染色標(biāo)記各組大鼠腦白質(zhì)內(nèi)的髓鞘，觀察其脫失情況。
　　4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠脾臟中CD4+CD25+Treg/CD4+T細(xì)胞比例變化。
　　5.放射免疫法檢測(cè)各組大鼠腦組織勻漿中IL-17A、TGF-β1因子含量變化。
　　6.酶聯(lián)

5、免疫吸附法(ELISA法)檢測(cè)血清中IFN-γ、IL-4因子含量變化。
　　7.將EAE對(duì)照組及VIP各劑量防治組指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:
　　(1)大鼠發(fā)病情況:正常對(duì)照組大鼠未發(fā)病，EAE對(duì)照組及VIP各劑量防治組大鼠均出現(xiàn)不同程度的臨床癥狀。發(fā)病大鼠先后表現(xiàn)為食量下降、精神萎靡、后肢無(wú)力、尾部拖地，在免疫后第14-17天癥狀最為典型:大鼠出現(xiàn)雙側(cè)后肢無(wú)力拖地、行走畫圈、爬行困難、自傷后肢、精神極度衰弱、抽

6、搐、甚至死亡。
　　①潛伏期:與EAE對(duì)照組比較，VIP各劑量防治組大鼠發(fā)病潛伏期均延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），VIP高劑量防治組潛伏期較VIP低劑量防治組延長(zhǎng)（P＜0.01）;
　?、谶M(jìn)展期:與EAE對(duì)照組比較，VIP各劑量防治組進(jìn)展期均縮短(P＜0.05、P＜0.01);VIP高劑量防治組進(jìn)展期較VIP低劑量防治組明顯縮短(P＜0.05);
　?、鄹叻迤谏窠?jīng)功能障礙評(píng)分:與EAE對(duì)照組相比，VIP低劑量

7、防治組神經(jīng)功能障礙評(píng)分降低，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，VIP高劑量防治組神經(jīng)功能障礙評(píng)分較EAE對(duì)照組及VIP低劑量防治組均明顯降低(P＜0.01)。
　　(2)腦脊髓組織病理改變:正常對(duì)照組大鼠腦脊髓未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn);與EAE對(duì)照組比較，VIP各劑量防治組炎細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分均顯著降(P＜0.01）;與VIP低劑量防治組比較，VIP高劑量防治組炎細(xì)胞浸潤(rùn)評(píng)分明顯降低(P＜0.01)。
　　(3)腦組織免疫組化結(jié)果

8、r>　?、傩切湍z質(zhì)細(xì)胞活化情況:正常對(duì)照組腦組織中未見(jiàn)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞;EAE對(duì)照組大鼠腦組織側(cè)腦室旁可見(jiàn)活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞呈彌漫性分布;VIP各劑量防治組中GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)有所減少，以血管周圍反應(yīng)明顯。與EAE對(duì)照組比較，VIP各劑量防治組腦組織側(cè)腦室旁GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值(IOD)明顯減小(P＜0.01、P＜0.05);與VIP低劑量防治組比較，VIP高劑量防治組GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值(IOD)明顯減小(P＜0.

9、01）;
　?、谒枨拭撌ё兓?正常對(duì)照組髓鞘保持完整;在EAE對(duì)照組、VIP各劑量防治組腦組織側(cè)腦室旁出現(xiàn)了不同程度脫髓鞘脫失。與EAE對(duì)照組比較，VIP各劑量防治組腦組織側(cè)腦室旁MBP染色陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值(IOD)明顯增加(P＜0.01、P＜0.05);與VIP低劑量防治組比較，VIP高劑量防治組腦組織側(cè)腦室旁MBP陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值(IOD)明顯增加(P＜0.01)。
　　(4)脾組織CD4+CD25+Treg

10、/CD4+T細(xì)胞比例變化:與正常對(duì)照組比較，EAE對(duì)照組脾組織中CD4+CD25+Treg/CD4+T細(xì)胞比例明顯降低(P＜0.01);與EAE對(duì)照組比較，VIP各劑量防治組大鼠脾組織中CD4+CD25+Treg/CD4+T細(xì)胞比例明顯升高(P＜0.01、P＜0.05);與VIP低劑量防治組比較，VIP高劑量防治組大鼠脾組織CD4+CD25+Treg/CD4+T細(xì)胞比例顯著上升(P＜0.01)。
　　(5)腦組織勻漿中IL-17A

11、、TGF-β1含量變化:與正常對(duì)照組比較，EAE對(duì)照組、VIP各劑量防治組大鼠腦組織勻漿IL-17A水平明顯升高(P均＜0.01）;與EAE對(duì)照組比較，VIP各劑量防治組大鼠腦組織勻漿中IL-17A水平均顯著降低(P＜0.01);與VIP低劑量防治組比較，VIP高劑量防治組腦組織勻漿中的IL-17A水平明顯降低(P＜0.01）。與正常對(duì)照組相比，EAE對(duì)照組、VIP各劑量防治組大鼠腦組織勻漿TGF-β1水平明顯降低(P＜0.01、P＜0

12、.05)，與EAE對(duì)照組相比，VIP各劑量防治組大鼠腦組織勻漿TGF-β1水平均顯著升高(P＜0.01）;與VIP低劑量防治組比較，VIP高劑量防治組大鼠腦組織勻漿中TGF-β1水平明顯上升（P＜0.01）;
　　(6)血清中IFN-γ、IL-4含量變化:與正常對(duì)照組比較，EAE對(duì)照組、VIP各劑量防治組大鼠血清中IFN-γ含量明顯升高(P＜0.01、P＜0.05);與EAE對(duì)照組比較，VIP各劑量防治組血清中IFN-γ含量顯著降

13、低(P＜0.01、P＜0.05);與VIP低劑量防治組比較，VIP高劑量防治組血清中IFN-γ含量明顯降低（P＜0.05）。與正常對(duì)照組比較，EAE對(duì)照組、VIP各劑量防治組大鼠血清中IL-4水平均明顯降低（P＜0.01）;與EAE對(duì)照組比較，VIP各劑量防治組血清中IL-4水平均顯著提高(P＜0.01);與VIP低劑量防治組比較，VIP高劑量防治組血清中IL-4水平明顯提高（P＜0.01）。
　　(7)相關(guān)性分析:
　?、?/p>

14、EAE對(duì)照組、VIP各劑量防治組大鼠發(fā)病高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分與腦組織勻漿中IL-17A含量及血清IFN-γ水平均呈正相關(guān)(P＜0.01），與脾組織中CD4+CD25+Treg/CD4+T細(xì)胞比例、腦組織勻漿中TGF-β1含量及血清中IL-4水平均呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。
　　②EAE對(duì)照組、VIP各劑量防治組大鼠發(fā)病高峰期炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度評(píng)分與腦組織勻漿中IL-17A含量及血清IFN-γ水平呈正相關(guān)（P＜0.01），與脾組織C

15、D4+CD25+Treg/CD4+T細(xì)胞比例、腦組織勻漿中TGF-β1含量及血清中IL-4水平呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01）。
　?、跡AE對(duì)照組、VIP各劑量防治組大鼠高峰期腦組織GFAP陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值(IOD)與腦組織勻漿中IL-17A含量及血清IFN-γ水平呈正相關(guān)（P＜0.01），與脾組織CD4+CD25+Treg/CD4+T細(xì)胞比例、腦組織勻漿中TGF-β1含量及血清中IL-4水平呈明顯負(fù)相關(guān)(P＜0.01）。

16、　　④EAE對(duì)照組、VIP各劑量防治組大鼠發(fā)病高峰期腦組織MBP陽(yáng)性表達(dá)的平均光密度值(IOD)與腦組織勻漿中IL-17A含量及血清IFN-γ水平與呈明顯負(fù)相關(guān)(P均＜0.01)，與脾組織CD4+CD25+Treg/CD4+T細(xì)胞比例、腦組織勻漿中TGF-β1含量及血清中IL-4水平呈正相關(guān)(P＜0.01）。
　　結(jié)論:
　　1.EAE大鼠存在Th1/Th2細(xì)胞因子、Th17/CD4+CD25+Treg細(xì)胞因子比例失衡。發(fā)病

17、高峰期體內(nèi)Th1型細(xì)胞因子IFN-γ及Th17型細(xì)胞因子IL-17升高，Th2型細(xì)胞因子IL-4及Treg細(xì)胞因子TGF-β1降低，免疫格局向Th1型偏移，同時(shí)破壞了CD4+CD25+Treg細(xì)胞介導(dǎo)的外周及中樞免疫耐受，該免疫平衡的破壞影響著EAE大鼠發(fā)病的潛伏期、進(jìn)展期和高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分。
　　2.VIP通過(guò)延長(zhǎng)EAE大鼠發(fā)病潛伏期、縮短進(jìn)展期、降低神經(jīng)功能障礙評(píng)分等緩解EAE的臨床癥狀，同時(shí)通過(guò)減輕腦脊髓組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)