α-硫辛酸對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎大鼠軸索損傷的保護(hù)作用.pdf

1、目的:多發(fā)性硬化(multipie sclerosis,MS)是一種常見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)脫髓鞘疾病。長(zhǎng)期以來(lái)一直認(rèn)為MS是以CNS廣泛的髓鞘脫失而軸索結(jié)構(gòu)相對(duì)保存為特征的原發(fā)性脫髓鞘癇變。直到上世紀(jì)九十年代末期國(guó)外學(xué)者證實(shí)在MS急性和慢性病灶中均存在軸索損傷,受損軸索多存在于硬化斑內(nèi)或其邊緣,在大體形態(tài)正常的白質(zhì)中也有少量的軸索破壞。病灶中的軸索損害引起wanerina變性,導(dǎo)致軸索

2、缺失。目前認(rèn)為軸索變性或損害是MS主要病理改變之一,在病程早期就開(kāi)始發(fā)生,而且可能是導(dǎo)致臨床上出現(xiàn)進(jìn)行性神經(jīng)功能障礙的主要因素。軸索損傷的程度與病情的嚴(yán)重程度相關(guān)。因此,目前對(duì)于多發(fā)性硬化軸索損傷機(jī)制以及相關(guān)的軸索損傷保護(hù)作用的探索正成為研究的熱點(diǎn)。
　　 軸索損害的原因和確切機(jī)制目前仍不清楚。目前一些國(guó)內(nèi)外研究表明:氧化應(yīng)激在MS的發(fā)病中起了非常重要的作用。氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的氧自由基及其他代謝產(chǎn)物可氧化體內(nèi)的生物大分子,誘發(fā)自

3、由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng),產(chǎn)生大量脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物,造成生物膜損傷,各種亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)破壞,酶活性降低或消失,引起細(xì)胞自溶。
　　 α-硫辛酸作為一種強(qiáng)的抗氧化劑,已引起人們的廣泛重視。它屬于維生素B類化合物,是一種天然抗氧化劑。它主要通過(guò)清除自由基,螯合金屬離子,再生其他抗氧化劑而來(lái)發(fā)揮其抗氧化作用。在國(guó)外,它通過(guò)干預(yù)氧化應(yīng)激過(guò)程,減少自由基對(duì)血管和神經(jīng)的損傷作用而被用于治療糖尿病周圍神經(jīng)病變并且已取得了較好的療效。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)α-硫辛酸及

4、于多發(fā)性硬化的研究很少,關(guān)于α-硫辛酸對(duì)MS軸索損傷是否具有保護(hù)作用。尚不清楚。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立多發(fā)性硬化模型-實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE),檢測(cè)大鼠發(fā)病過(guò)程中軸索損傷相關(guān)指標(biāo),了解MS發(fā)病過(guò)程中軸索損傷情況。通過(guò)α-硫辛酸對(duì)EAE大鼠的干預(yù)來(lái)觀察軸索損傷指標(biāo)的相應(yīng)變化,了解對(duì)軸索損傷的保護(hù)作用,從而為臨床治療MS提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1動(dòng)物分組:將80只成年健康雌性Wista

5、r大鼠,體重180～200g,隨機(jī)分出正常對(duì)照組(NC組)6只,其余用新鮮豚鼠全脊髓勻漿(GPSCH)誘導(dǎo)免疫,待第一次發(fā)病后隨機(jī)選出發(fā)病組(DIS組)大鼠6只,其余平均分為EAE組、硫辛酸組(LA組,100mg·kg-1·d-1)和地塞米松組(DXM組,2mg·kg-1·d-1)。其中EAE和各藥物干預(yù)組再按病程分為緩解組(REM組)、復(fù)發(fā)組(REL組)兩個(gè)亞組,每亞組6只,藥物干預(yù)組動(dòng)物無(wú)復(fù)發(fā)者,按預(yù)實(shí)驗(yàn)中統(tǒng)計(jì)的EAE組動(dòng)物緩解復(fù)發(fā)

6、平均天數(shù)分為干預(yù)后7天組(LA7d組:DXM7d組)和干預(yù)后14天組(LA14d組;DXM14d組)。
　　 2模型制備:將新鮮豚鼠全脊髓制成勻漿,加上等量完全福氏佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA)制成完全免疫抗原。0.5 ml/只,分別于大鼠四肢足墊和背部皮下注射。藥物治療組于動(dòng)物發(fā)病后第一天起給予相應(yīng)劑量腹腔注射,連續(xù)注射7天。
　　 3神經(jīng)功能評(píng)分:于免疫誘導(dǎo)當(dāng)日及免疫后每天對(duì)動(dòng)物

7、的體重變化、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況進(jìn)行觀察,并對(duì)動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,采用國(guó)際通用的Kono評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),分為5分:1分動(dòng)物尾部無(wú)力;2分尾部無(wú)力+肢體無(wú)力;3分肢體輕度麻痹;4分肢體嚴(yán)重麻痹,被動(dòng)翻身后不能復(fù)原:5分瀕死狀態(tài)或死亡。
　　 4組織病理學(xué):在動(dòng)物麻醉狀態(tài)下,快速取其脊髓腰膨大組織,4％多聚甲醛固定,石蠟包埋,組織切片。行改良的三色染色和改良Bielschowsky銀染色,光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)改變。
　　 5免疫

8、組織化學(xué)染色:取動(dòng)物脊髓腰膨大處組織,石蠟包埋,做6μm橫截面切片,血清封閉,分別加神經(jīng)絲蛋白(NF,Neurofilament protein)和β-淀粉樣前體蛋白(β-APP,β-amyloid precursor protein)的一抗,經(jīng)二抗、三抗孵育,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水透明,中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察NF和β-APP的表達(dá)情況。
　　 6β-APP的免疫印跡(Western Blot):動(dòng)物麻醉狀態(tài)下,迅

9、速取脊髓腰膨大處組織置于-80℃冰箱內(nèi)備用。提取蛋白,電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉,加一抗,洗膜,加二抗,洗膜,顯色。圖像采集,數(shù)據(jù)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1動(dòng)物復(fù)發(fā)情況觀察:EAE組動(dòng)物復(fù)發(fā)率58.3％,LA組動(dòng)物復(fù)發(fā)率8.3％,DXM組動(dòng)物無(wú)復(fù)發(fā)。LA組、DXM組復(fù)發(fā)率均小于EAE組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。LA組與DXM組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 2動(dòng)物行為學(xué)觀察:在動(dòng)物緩解期(發(fā)病后第7天)

10、和復(fù)發(fā)期(發(fā)病后第14天)時(shí)神經(jīng)功能評(píng)分比較:(1)緩解期:LA組、DXM組評(píng)分均小于EAE組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),LA組與DXM組之間評(píng)分比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);(2)復(fù)發(fā)期:LA組、DXM組評(píng)分均小于EAE組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),LA組、DXM組之間評(píng)分比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3組織病理學(xué)觀察:
　　 3.1改良三色染色:
　　 結(jié)果顯示:正常對(duì)照組軸索絕大多數(shù)

11、粗細(xì)均勻,走行方向較一致,軸索的連續(xù)性完好。余各組均不同程度出現(xiàn)軸索改變,可見(jiàn)軸突腫脹、增粗、彎曲,著色不均,呈鋸齒狀或串珠狀,不連續(xù),甚至斷裂。髓鞘結(jié)構(gòu)層次紊亂,疏松,崩解;
　　 3.2改良Bielschowsky銀染色:
　　 結(jié)果顯示:正常對(duì)照組軸索絕大多數(shù)粗細(xì)均勻,走行方向較一致,軸索的連續(xù)性完好。余各組均不同程度出現(xiàn)軸索改變,包括軸索腫脹、粗細(xì)不均、畸形,部分出現(xiàn)空泡狀淡染,有的甚至出現(xiàn)斷裂,部分形成收縮球。

12、
　　 4免疫組織化學(xué)染色:
　　 4.1脊髓組織中NF表達(dá):
　　 結(jié)果顯示:正常組NF表達(dá)量最多;與正常組相比,發(fā)病期NF表達(dá)量減少,緩解期表達(dá)量有所增加,復(fù)發(fā)期表達(dá)量再次減少,差異均有顯著性,p＜0.05;經(jīng)LA和DXM藥物干預(yù)后NF表達(dá)量有所增加,差異有顯著性,p＜0.05。
　　 4.2脊髓組織中β-APP表達(dá):
　　 結(jié)果顯示:正常組β-APP有所表達(dá),但量很少;與正常組相比,發(fā)病期β

13、-APP表達(dá)量增多,緩解期表達(dá)量有所減少,復(fù)發(fā)期表達(dá)量再次增多,差異均有顯著性,p＜0.05;經(jīng)LA和DXM藥物干預(yù)后β-APP表達(dá)量有所下降,差異有顯著性,p＜0.05。
　　 5脊髓組織中β-APP的免疫印跡結(jié)果:正常組β-APP有所表達(dá),但量很少;與正常組相比,發(fā)病期β-APP表達(dá)量增多,緩解期表達(dá)量有所減少,復(fù)發(fā)期表達(dá)量再次增多,差異均有顯著性,p＜0.05;經(jīng)LA和DXM藥物干預(yù)后β-APP表達(dá)量有所下降,差異有顯著性

14、,p＜0.05。結(jié)果與β-APP的免疫組織化學(xué)的結(jié)果相一致。
　　 結(jié)論:
　　 1硫辛酸可以促進(jìn)EAE大鼠的病情緩解,降低動(dòng)物復(fù)發(fā)率。
　　 2通過(guò)改良三色染色和改良的Bielschowsky銀染色法,均可見(jiàn)在EAE大鼠中存在軸索損傷的病理改變。
　　 3 EAE大鼠脊髓組織中β-APP和NF的表達(dá)均與病情活動(dòng)性相關(guān),隨病程發(fā)展呈一定的變化趨勢(shì),藥物干預(yù)對(duì)各指標(biāo)有一定影響。
　　 4硫辛酸對(duì)EA