二甲雙胍對實驗性自身免疫性腦脊髓炎的保護作用及作用機制探討.pdf

1、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)是以炎細胞浸潤、髓鞘脫失和繼發(fā)軸索損傷為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerves system, CNS)自身免疫性脫髓鞘疾病。MS的病因復(fù)雜，涉及環(huán)境、遺傳易感性等諸多因素。盡管其發(fā)病機制尚未完全闡明，但越來越多的證據(jù)表明，抗原特異性Th17細胞介導(dǎo)的異常免疫反應(yīng)和執(zhí)行免疫耐受的調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的功能異常在MS的發(fā)病機制中起到重要作用。
　　Th17細

2、胞在外周免疫器官的生成及其向CNS的浸潤，在MS和實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)的發(fā)病機制中都起到重要的作用。Th17細胞及其特征性細胞因子interleukin(IL)-17通過多種機制參與MS病理損傷過程，IL-17可以通過與血腦屏障(blood–brain barrier, BBB)中內(nèi)皮細胞表達的IL-17R結(jié)合，減少緊密結(jié)合蛋白表達而破壞

3、 BBB，促進炎細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤，誘導(dǎo)促炎因子生成等多種途徑進一步加重免疫反應(yīng)。而 Treg細胞可以通過細胞接觸依賴的途徑來達到對自身反應(yīng)效應(yīng)T細胞活化和增殖的控制。
　　外界抗原等刺激可以使淋巴細胞向不同的細胞功能亞群分化，不同功能的T細胞亞群需要不同的能量和生物合成途徑來維持其特殊功能需要。隨著不斷的研究，細胞代謝已經(jīng)被認為是 T細胞特殊功能的重要調(diào)節(jié)因素，在激活的效應(yīng) T細胞中為滿足生物合成的需要和產(chǎn)生足夠的能量，細胞

4、代謝方式從以氧化磷酸化為主向有氧糖酵解為主轉(zhuǎn)換。相反，在靜止T細胞和Treg細胞中，氧化磷酸化卻作為主要能量供應(yīng)代謝方式。
　　哺乳動物雷帕霉素靶(Mammalian target of rapamycin, mTOR)是一種進化保守的絲氨酸蘇氨酸激酶，除了在調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、存活、代謝等方面起作用外，在輔助 T細胞的活化和分化過程中也具有至關(guān)重要的作用。mTOR及其下游低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducer fac

5、tor-1α, HIF-1α)參與的糖酵解代謝在Th17細胞的分化發(fā)展過程中起到重要作用。HIF-1α還調(diào)節(jié)多種參與糖酵解代謝的基因，包括葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(glucose transport protein1, Glut1)、丙酮酸激酶M2(pyruvate kinase M2, PKM2)，而這些基因編碼了參與調(diào)節(jié)糖酵解代謝的酶，并在效應(yīng) T細胞的分化及功能決定過程中起作用。
　　腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated

6、protein kinase, AMPK)是受多種代謝刺激調(diào)控的高度保守的細胞能量感受器，AMPK和mTOR在調(diào)節(jié)細胞代謝和免疫的信號連接途徑中起到相反的作用，AMPK可以通過磷酸化結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體2(Tuberous sclerosis complex2, TSC2)、mTORC1的結(jié)構(gòu)蛋白raptor來抑制mTOR的功能。AMPK可以通過抑制mTOR介導(dǎo)的糖酵解代謝和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝進而影響Th17細胞和Treg細胞的產(chǎn)生。
　　

7、二甲雙胍(metformin, MET)是廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的一線臨床用藥。它的藥理作用和 AMPK的激活有關(guān)。二甲雙胍除了降糖作用外，在抗炎、抗氧化、輔助巨噬細胞向不同類型轉(zhuǎn)換等方面的作用逐漸被人們關(guān)注，并已有用于治療除糖尿病外的多種疾病的實驗研究?；?mTOR及AMPK的相互作用及其通路對于效應(yīng)T細胞的可能作用，我們考慮MET可能對EAE具有保護作用，且這種保護作用是通過對于T細胞的調(diào)節(jié)達到的。在我們的研究中，我們利用MOG35

8、-55免疫C57BL/6小鼠制備EAE模型，觀察給予MET干預(yù)是否對于EAE具有保護作用，以及它對 EAE模型中 Th17細胞和 Treg細胞反應(yīng)的影響，并對 MET是否通過調(diào)節(jié)mTOR/HIF-1α通路來進一步調(diào)節(jié)Th17/Treg細胞平衡進行研究。
　　第一部分二甲雙胍通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細胞平衡改善實驗性自身免疫腦脊髓炎病情
　　目的:建立C57BL/6小鼠EAE模型，應(yīng)用二甲雙胍干預(yù)，觀察用藥干預(yù)組和EAE模型

9、組發(fā)病情況及脊髓中炎性細胞浸潤情況，觀察兩組中Th17細胞和Treg細胞數(shù)量變化及相應(yīng)的特征性炎癥因子、轉(zhuǎn)錄因子的變化。
　　方法：
　　1采用近交系雌性C57BL/6小鼠作為實驗動物，周齡8-10周，體重為18-20g。應(yīng)用 MOG35-55作為抗原，與完全弗氏佐劑和結(jié)核菌素混合后給予小鼠背部皮下注射，并于免疫當天（即第0h）及第2天（即48h）分兩次腹腔注射0.5ml百日咳毒素(PTX)，建立EAE動物模型。
　　

10、2將雌性C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組、EAE模型組和MET治療組。自免疫后第1天（免疫當日記作第0天）開始，MET治療組小鼠給予每日腹腔注射MET100mg/kg，正常對照組及EAE模型組小鼠每日腹腔注射等量的生理鹽水。自免疫日開始，每日給予小鼠兩次神經(jīng)功能評分，并測量體重，連續(xù)觀察30天，神經(jīng)功能評分采用Knoz評分法。
　　3應(yīng)用HE染色對小鼠脊髓切片進行染色，觀察脊髓組織中炎性細胞浸潤程度。
　　4應(yīng)用流式細胞

11、檢測技術(shù)檢測各組小鼠脾細胞培養(yǎng)懸液中Th17細胞和Treg細胞的比例。
　　5應(yīng)用ELISA檢測方法檢測脾細胞培養(yǎng)上清中的炎癥因子IL-17A、IL-10、TGF-β含量。
　　6應(yīng)用 qPCR方法檢測小鼠脾組織及脊髓組織中炎癥因子 IL-17A、IL-10、TGF-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平和Th17細胞和Treg細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt、Foxp3mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　　7采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。實

12、驗數(shù)據(jù)以"均數(shù)±標準差"((-x)±s)表示。對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗。發(fā)病率用卡方檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，以百分比表示。臨床神經(jīng)功能評分用Mann–Whitney U檢驗。多組計量資料均數(shù)的比較：方差齊時應(yīng)用ONE-WAY-ANOVA中SNK-q檢驗進行方差分析，方差不齊時應(yīng)用非參數(shù)秩和檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:1 MET對于EAE發(fā)病率及臨床評分的影：MET降低了EAE的發(fā)病率（P<0.05）

13、并改善了EAE發(fā)病的臨床癥狀（P<0.01）。2 MET減少EAE中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細胞浸潤：發(fā)病高峰期EAE模型組小鼠脊髓組織炎癥評分較 MET治療組比較明顯增加（P<0.01）。3 MET減輕 EAE中Th17細胞反應(yīng)：流式細胞檢測Th17細胞含量顯示MET治療組Th17細胞比例較EAE模型組下降（P<0.01）。ELISA檢測脾細胞上清培養(yǎng)液中IL-17A含量顯示MET治療組細胞因子IL-17A含量低于EAE模型組（P<0.01）。

14、qPCR檢測結(jié)果顯示脾組織中 Th17細胞的特征性轉(zhuǎn)錄因子RORγt mRNA轉(zhuǎn)錄水平在MET治療組下降（P<0.01）。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，IL-17A和RORγt mRNA轉(zhuǎn)錄水平在MET治療組中下降（P<0.01）。4 MET促進了EAE中Treg細胞反應(yīng)：流式細胞檢測Treg細胞含量顯示MET治療組Treg細胞比例較EAE模型組提高（P<0.01）。ELISA檢測脾細胞上清培養(yǎng)液中 IL-10、TGF-β顯示 MET治療組細胞因子

15、含量高于EAE模型組（P<0.01）。qPCR檢測結(jié)果顯示脾組織中IL-10、TGF-β和Foxp3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在MET治療組中提高（P<0.01）。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中， IL-10、TGF-β和 Foxp3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平在 MET治療組中提高（P<0.01）。
　　第二部分 AMPK/mTOR信號通路中涉及代謝的分子在實驗性自身免疫性腦脊髓炎疾病中的動態(tài)變化
　　目的:建立C57BL/6小鼠EAE模型，按照疾病模型

16、發(fā)病規(guī)律將病程分為發(fā)病初期、發(fā)病高峰期、疾病緩解期，在發(fā)病各個時期檢測 AMPK及mTOR/HIF-1α通路參與細胞代謝的HIF-1α、Glut1、PKM2的表達情況。
　　方法：
　　1采用近交系雌性C57BL/6小鼠作為實驗動物，周齡8-10周，體重為18-20g。應(yīng)用 MOG35-55作為抗原，與完全弗氏佐劑和結(jié)核菌素混合后給予小鼠背部皮下注射，并于免疫當天（即第0h）及第2天（即48h）分兩次腹腔注射0.5ml百日咳

17、毒素(PTX)，建立EAE動物模型。自免疫日開始，每日給予小鼠兩次神經(jīng)功能評分，并測量體重連續(xù)觀察30天，神經(jīng)功能評分采用Knoz評分法。
　　2根據(jù)疾病病程在發(fā)病初期（免疫后13d）、發(fā)病高峰期（免疫后20d）、疾病緩解期（免疫后30d）分別對EAE小鼠脾組織進行取材，應(yīng)用Western blot方法檢測脾組織中AMPK、qAMPK、HIF-1α蛋白表達，應(yīng)用 qPCR檢測方法檢測脾組織中HIF-1α、Glut1、PKM2及Th

18、17細胞特征性細胞因子IL-17，特征性轉(zhuǎn)錄因子RORγt，Treg細胞特征性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　　3采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以"均數(shù)±標準差"((-x)±s)表示。對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗。多組計量資料均數(shù)的比較：方差齊時應(yīng)用ONE-WAY-ANOVA中SNK-q檢驗進行方差分析，方差不齊時應(yīng)用非參數(shù)秩和檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:1 EA

19、E發(fā)病情況：EAE組小鼠的發(fā)病率為100％,平均發(fā)病時間為12.40±1.83天，平均達峰時間為19.0±1.25天。高峰期神經(jīng)功能評分2.85±0.24分。2 HIF-1α在疾病發(fā)病過程中的變化：Western blot結(jié)果顯示發(fā)病初期較正常對照組無明顯變化；發(fā)病高峰期HIF-1α表達較正常對照組明顯增高（P<0.01）。發(fā)病高峰期HIF-1α表達較發(fā)病初期增高(P<0.05)。發(fā)病高峰期HIF-1α表達較發(fā)病緩解期增高。發(fā)病緩解期較

20、正常對照組無明顯變化。qPCR結(jié)果顯示發(fā)病高峰期HIF-1αmRNA轉(zhuǎn)錄較正常對照升高(P<0.01)。發(fā)病高峰期HIF-1α mRNA轉(zhuǎn)錄較發(fā)病初期增高。發(fā)病高峰期與發(fā)病緩解期相比，HIF-1α mRNA轉(zhuǎn)錄增高。發(fā)病緩解期較正常對照組HIF-1αmRNA轉(zhuǎn)錄增高(P<0.05)。3 Glut1在疾病發(fā)病過程中的變化：PCR結(jié)果顯示發(fā)病初期、發(fā)病高峰期、發(fā)病緩解期較正常對照組Glut1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平增高(發(fā)病初期、發(fā)病高峰期P<0

21、.01，發(fā)病緩解期P<0.05)。發(fā)病高峰期與發(fā)病初期相比，Glut1 mRNA轉(zhuǎn)錄增高(P<0.01)。發(fā)病高峰期與發(fā)病緩解期相比，Glut1 mRNA轉(zhuǎn)錄增高(P<0.01)。發(fā)病初期較發(fā)病緩解期Glut1 mRNA轉(zhuǎn)錄增高(P<0.05)。4 PKM2在疾病發(fā)病過程中的變化：qPCR結(jié)果顯示發(fā)病高峰期PKM2 mRNA轉(zhuǎn)錄較正常對照、發(fā)病初期、緩解期相比升高(P<0.01)。發(fā)病初期、緩解期較正常對照組相比無明顯變化。5 RORγ

22、t在疾病發(fā)病過程中的變化：qPCR結(jié)果顯示發(fā)病初期、發(fā)病高峰期、發(fā)病緩解期較正常對照組RORγt mRNA轉(zhuǎn)錄水平增高(P<0.01)。發(fā)病高峰期較發(fā)病初期，緩解期相比， RORγt mRNA轉(zhuǎn)錄水平增高(P<0.01)。緩解期較發(fā)病初期比，RORγt mRNA轉(zhuǎn)錄水平增高(P<0.05)。6 IL-17在疾病發(fā)病過程中的變化：qPCR結(jié)果顯示發(fā)病高峰期、發(fā)病緩解期較正常對照組IL-17 mRNA轉(zhuǎn)錄增高(P<0.01)。發(fā)病高峰期、發(fā)

23、病緩解期較發(fā)病初期相比，IL-17 mRNA轉(zhuǎn)錄增高(P<0.01)。高峰期較緩解期比， IL-17 mRNA轉(zhuǎn)錄增高(P<0.01)。7 AMPKα在疾病發(fā)病過程中活化程度的變化：Western blot結(jié)果顯示發(fā)病初期、發(fā)病高峰期較正常對照組無明顯變化；發(fā)病高峰期較發(fā)病初期AMPKα蛋白磷酸化程度增高(P<0.05)。發(fā)病緩解期較正常對照組、發(fā)病初期、發(fā)病高峰期相比，AMPKα蛋白磷酸化程度明顯增高(P<0.01)。8 Foxp3在

24、疾病發(fā)病過程中的變化：qPCR結(jié)果顯示發(fā)病初期、高峰期較正常對照組Foxp3mRNA轉(zhuǎn)錄無明顯變化。發(fā)病緩解期較發(fā)病初期、發(fā)病高峰期相比， Foxp3 mRNA轉(zhuǎn)錄增高(P<0.01)。發(fā)病緩解期較正常對照組相比，F(xiàn)oxp3 mRNA轉(zhuǎn)錄無明顯變化。
　　第三部分二甲雙胍通過激活A(yù)MPK抑制mTOR/HIF-1α通路發(fā)揮對實驗性自身免疫性腦脊髓炎的保護作用
　　目的:建立C57BL/6小鼠EAE模型，給予二甲雙胍干預(yù)，觀察E

25、AE模型組和 MET治療組小鼠脾組織中 AMPK激活水平的變化及其對下游mTOR活性抑制的變化情況。并對 mTOR/HIF-1α通路參與細胞代謝的HIF-1α、Glut1、PKM2在兩組中的表達差異進行比較。
　　方法：
　　1采用近交系雌性C57BL/6小鼠作為實驗動物，周齡8-10周，體重為18-20g。應(yīng)用 MOG35-55作為抗原，與完全弗氏佐劑和結(jié)核菌素混合后給予小鼠背部皮下注射，并于免疫當天（即第0h）及第2天（

26、即48h）分兩次腹腔注射0.5ml百日咳毒素(PTX)，建立EAE動物模型。
　　2將雌性 C57BL/6小鼠隨機分為正常對照組、EAE模型組和 MET治療組。自免疫后第1天（免疫當日記作第0天）開始，MET治療組小鼠給予每日腹腔注射MET100mg/kg，正常對照組及EAE模型組小鼠每日腹腔注射等量的生理鹽水。自免疫日開始，每日給予小鼠兩次神經(jīng)功能評分，并測量體重，神經(jīng)功能評分采用Knoz評分法。
　　3在疾病高峰期對各組

27、小鼠脾組織取材，應(yīng)用Western blot方法檢測脾組織中AMPK、pAMPK、S6K1、pS6K1、HIF-1α、IL-17蛋白表達情況，應(yīng)用qPCR檢測方法檢測脾組織中HIF-1α、Glut1、PKM2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。
　　4采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以"均數(shù)±標準差"((-x)±s)表示。對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗。多組計量資料均數(shù)的比較：方差齊時應(yīng)用ONE-WAY-ANOVA中SNK-

28、q檢驗進行方差分析，方差不齊時應(yīng)用非參數(shù)秩和檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:1 Western Blot方法檢測脾組織中pAMPKα/AMPKα：EAE模型組較正常對照組pAMPKα/AMPKα比較無明顯差異。MET治療組較正常對照組、EAE模型組pAMPKα/AMPKα表達增加(P<0.01)。2 Western Blot方法檢測脾組織中 pS6K1/S6K1：EAE模型組較正常對照組比較pS6K1/S6K

29、1升高(P<0.01)。MET治療組較EAE模型組比較pS6K1/S6K1減低(P<0.05)。MET治療組較正常對照組比較pS6K1/S6K1無明顯變化。3 Western Blot、qPCR檢測脾組織中HIF-1α蛋白表達水平及mRNA轉(zhuǎn)錄：Western Blot結(jié)果顯示EAE模型組較正常對照組比較HIF-1α蛋白表達升高(P<0.01)。MET治療組較 EAE模型組比較 HIF-1α蛋白表達減低(P<0.01)。MET治療組較正

30、常對照組比較HIF-1α蛋白表達無明顯變化。qPCR結(jié)果顯示EAE模型組較正常對照組比較HIF-1αmRNA轉(zhuǎn)錄水平升高(P<0.01)。MET治療組較EAE模型組比較HIF-1αmRNA轉(zhuǎn)錄水平減低(P<0.01)。MET治療組較正常對照組比較HIF-1αmRNA轉(zhuǎn)錄水平升高(P<0.01)。4 Western Blot、qPCR方法檢測脾組織中IL-17蛋白表達水平及mRNA轉(zhuǎn)錄：Western Blot結(jié)果顯示EAE模型組較正常對

31、照組比較IL-17蛋白表達升高(P<0.01)。MET治療組較EAE模型組比較IL-17α蛋白表達減低(P<0.05)。MET治療組較正常對照組比較 IL-17蛋白表達無明顯變化。qPCR結(jié)果顯示EAE模型組較正常對照組比較IL-17mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高(P<0.01)。MET治療組較EAE模型組比較IL-17mRNA轉(zhuǎn)錄水平減低(P<0.01)。MET治療組較正常對照組比較 IL-17mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高(P<0.01)。5 qPCR

32、方法檢測脾組織中Glut1mRNA轉(zhuǎn)錄：EAE模型組較正常對照組比較 Glut1mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高(P<0.01)。MET治療組較EAE模型組比較Glut1mRNA轉(zhuǎn)錄水平減低(P<0.01)。MET治療組較正常對照組比較 Glut1轉(zhuǎn)錄水平減低(P<0.05)。6 qPCR方法檢測脾組織中PKM2 mRNA轉(zhuǎn)錄：EAE模型組較正常對照組比較PKM2mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高(P<0.01)。MET治療組較EAE模型組比較PKM2mRNA轉(zhuǎn)

33、錄水平減低(P<0.01)。MET治療組較正常對照組比較PKM2mRNA轉(zhuǎn)錄水平減低(P<0.01)。
　　結(jié)論：
　　1應(yīng)用MOG35-55免疫C57BL/6雌性小鼠成功建立EAE模型，給予MET干預(yù)可以降低動物發(fā)病率并減輕了EAE發(fā)病的臨床癥狀，抑制了炎癥細胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)的浸潤。
　　2應(yīng)用MET干預(yù)，通過調(diào)節(jié)Th17/Treg細胞比例，調(diào)節(jié)Th17細胞和Treg細胞的特征性炎癥因子和轉(zhuǎn)錄因子在外周免疫器官和中樞