馬索羅酚和丹參酮ⅡA對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠治療作用的病理學(xué)研究.pdf

1、目的:中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病是部位發(fā)生在腦和脊髓，主要特征是髓鞘損傷，而神經(jīng)元胞體和軸索損害相對較輕的一組疾病。多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是由免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性脫髓鞘性疾病，病因及發(fā)病機(jī)制迄今不明，最新研究表明，MS的病因與遺傳因素和環(huán)境因素有關(guān)，而疾病導(dǎo)致的髓鞘脫失和軸索變性是患者表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺損，病程呈現(xiàn)為緩解-復(fù)發(fā)和病情持續(xù)進(jìn)展的主要原因。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimenta

2、l autoimmune encephalomyelitis，EAE)是MS經(jīng)典的動物模型，其病程上可以表現(xiàn)為復(fù)發(fā)-緩解，很接近于人類MS的臨床表現(xiàn)及病理特征。本研究應(yīng)用MOG35-55建立EAE動物模型，在EAE小鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀后開始給予馬索羅酚和丹參酮ⅡA治療，模擬臨床的治療時間，通過HE染色觀察兩種藥物對EAE動物模型是否有抗炎作用，通過羅克沙爾堅牢藍(lán)(Luxol Fast Blue)特殊髓鞘染色和Bielschowsky's神經(jīng)

3、軸索染色從病理學(xué)和形態(tài)學(xué)的角度觀察馬索羅酚和丹參酮ⅡA是否能夠減輕CNS髓鞘的脫失，減輕軸索病理損傷，降低EAE小鼠的神經(jīng)功能評分。
　　方法:本研究采用了45只8-12周齡，健康C57BL/6雌性小鼠，小鼠隨機(jī)分成三組即EAE組、NDGA組和DANⅡA組，以MOG35-55為抗原免疫C57BL/6小鼠建立EAE模型。用生理鹽水將抗原MOG35-55稀釋成為5mg/ml的液體狀態(tài)，然后將完全弗氏佐劑（其中包含的結(jié)核桿菌H37Ra的

4、終濃度為4mg/ml）按1∶1的體積加入并混合均勻，乳化后按每只0.1ml在小鼠脊柱兩側(cè)的皮膚下分四點(diǎn)注射，免疫后的當(dāng)天即第0h及第48h腹腔內(nèi)注射500ngPTX（1000ng/只）。小鼠發(fā)病后，自神經(jīng)功能評分達(dá)到1分以上時開始給予藥物治療，即EAE組小鼠腹腔注射5％DMSO，NDGA組小鼠腹腔注射馬索羅酚，DANⅡA組小鼠腹腔注射丹參酮，分別于治療前，治療10d，治療20d取材，每組各取5只。取材部位為小鼠脊髓腰膨大處，組織進(jìn)行石蠟

5、包埋，分別通過HE染色觀察病變部位炎性反應(yīng)程度和血管套形成的情況，羅克沙爾堅牢藍(lán)(Luxol Fast Blue)特殊髓鞘染色和Bielschowsky's神經(jīng)軸索染色從病理學(xué)及形態(tài)學(xué)的角度觀察馬索羅酚和丹參酮ⅡA兩種藥物能否可以減輕小鼠病變部位的髓鞘脫失，減輕組織的軸索損傷，降低EAE小鼠的神經(jīng)功能評分起到治療作用。應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果為計量資料則均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±S）表示，而多組計量資料均數(shù)的比較則采

6、用ANOVA方差分析，若不滿足正態(tài)分布或方差齊性，則采用秩和檢驗(yàn)的方法，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1動物臨床癥狀及評分觀察:
　　1.1臨床癥狀:
　　45只小鼠全部在10-16d內(nèi)開始發(fā)病，表明EAE動物模型制作成功，可以給予藥物干預(yù)治療，EAE組小鼠免疫后全部發(fā)病，出現(xiàn)皮毛粗糙、精神萎靡不振、行走困難、喪失食欲、體重減輕等表現(xiàn)。臨床表現(xiàn)最嚴(yán)重在發(fā)病高峰期，小鼠出現(xiàn)雙后肢甚至全部四肢肌

7、力降低甚至全部癱瘓、大便、小便均失禁、不能夠自主翻身，個別成垂死狀態(tài)，并且持續(xù)較長時間。治療組的小鼠免疫后也全部發(fā)病，于癥狀評分達(dá)到1分以上時給予藥物干預(yù)，治療前與EAE組臨床癥狀評分無顯著差異，治療10天后，此時EAE處于發(fā)病高峰期，臨床表現(xiàn)嚴(yán)重，而給予丹參酮及馬索羅酚治療的小鼠出現(xiàn)尾部癱瘓或者雙后肢輕癱或全癱，無大小便失禁及不能自主翻身等癥狀，治療20天后，EAE小鼠隨著病程發(fā)展，癥狀有所緩解，但仍遺留尾部癱瘓或后肢癱瘓等癥狀，給予

8、丹參酮及馬索羅酚治療的小鼠癥狀緩解較快，臨床癥狀表現(xiàn)更輕，僅表現(xiàn)為尾部輕癱或者尾部無力等癥狀。
　　1.2臨床評分觀察:
　　計算并比較各組中每只小鼠于治療10d及治療20d的臨床評分均數(shù)。EAE組小鼠神經(jīng)功能評分高于丹參酮組及馬索羅酚組(P＜0.05)。丹參酮組及馬索羅酚組小鼠神經(jīng)功能評分相比較，差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2 HE染色:
　　2.1治療前三組可見散在炎性細(xì)胞浸潤，大部分集中在脊髓

9、白質(zhì)附近。
　　2.2治療10天 EAE組可見大片狀炎性細(xì)胞的浸潤，甚至形成了“血管袖套”現(xiàn)象，即脊髓多處小血管周圍，特別是小靜脈四周出現(xiàn)了炎癥細(xì)胞，大部分為淋巴細(xì)胞，病變大多在前角白質(zhì)，灰白質(zhì)交界及前正中裂血管周圍，丹參酮組及馬索羅酚組“血管袖套”形成較少，炎性細(xì)胞主要集中于小血管周圍，三組HE病理評分有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.3治療20天 EAE組炎性細(xì)胞和“血管袖套”減少，丹參酮組及馬索羅酚組炎性細(xì)胞更少，“血管袖套”消

10、失，三組HE病理評分有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3 LFB染色:
　　三組小鼠在治療前，髓鞘并無明顯的脫失部位，但仍能觀察到脊髓白質(zhì)內(nèi)部分髓鞘變薄，顏色變淺。EAE組在發(fā)病高峰期可觀察到脊髓內(nèi)存在大小不等的片狀脫髓鞘區(qū)域，病變大多表現(xiàn)在前后角周圍內(nèi)的白質(zhì)，藍(lán)色髓鞘部位減少，顏色變淡，甚至出現(xiàn)了大片狀氣球樣空泡變性的髓鞘脫失區(qū)域，髓鞘脫失部位常伴隨著大片炎癥細(xì)胞浸潤，表明髓鞘脫失和炎癥浸潤有一定關(guān)系，在治療20d后較高峰期脫髓鞘區(qū)域內(nèi)

11、病變無明顯改變;而丹參酮組及馬索羅酚組在治療10d后可見部分髓鞘變薄，顏色變淺，存在一些小的髓鞘脫失區(qū)，但沒有形成大片狀髓鞘脫失區(qū)域，病灶散在成點(diǎn)灶狀，治療20d較治療前及治療10d髓鞘變粗，藍(lán)色髓鞘區(qū)域有所增加，三組髓鞘病理評分在治療10d及治療20d均具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4.Bielschowsky's神經(jīng)軸索染色:
　　4.1治療前:三組小鼠均已存在軸索損傷，損傷的軸索表現(xiàn)為形狀不規(guī)則、排列紊亂、腫脹扭曲。
　

12、　4.2治療10天: EAE組處于發(fā)病高峰期，軸索損傷更為明顯，病灶成大片狀，形態(tài)更加不規(guī)則，直徑大小不一，軸索斷裂，斷端形成卵圓小體，甚至出現(xiàn)軸索的消失，部位與炎性細(xì)胞浸潤及髓鞘的脫失具有一致性，并且與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，丹參酮組及馬索羅酚組軸索也存在損失，但范圍及程度與EAE組相比較輕。
　　4.3治療20天:EAE組在治療20d后與治療10天相比，無明顯變化，丹參酮組及馬索羅酚組損傷較治療前及治療10d較輕。
　　結(jié)論