單一-復(fù)合抗原誘導(dǎo)的大鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型的建立及其病理學(xué)研究.pdf

1、目的：多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）白質(zhì)脫髓鞘病變?yōu)樘攸c(diǎn)的自身免疫性疾病，具有反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)。由于MS發(fā)病率較高，呈慢性病程且傾向于青年人罹患，使其成為重要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。由于可從MS病人得到的資料有限，因此建立理想的動(dòng)物模型是進(jìn)一步研究MS發(fā)病機(jī)制及治療的前提和基礎(chǔ)。
　　 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental

2、autoimmune encephalomyelitis，EAE）是一種以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周圍單個(gè)核細(xì)胞浸潤及髓鞘脫失為特征的自身免疫性疾病，是研究人類脫髓鞘疾病MS的理想動(dòng)物模型。
　　 傳統(tǒng)的EAE模型是以脊髓勻漿為抗原免疫大鼠而建立的，但其抗原成分復(fù)雜，限制了EAE細(xì)胞分子水平的研究，為探索抗原劑量及成分與EAE的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)首先嘗試以小劑量豚鼠脊髓勻漿（guinea pig spinal cord homogenat

3、e，GPSCH）建立Wistar大鼠EAE模型，為進(jìn)一步明確脊髓中具體抗原成分的致腦炎作用及其量的大小與EAE的關(guān)系，本研究又以髓鞘堿性蛋白片段MBP69-85（myelin basic protein，MBP）作為單一成分抗原建立起EAE動(dòng)物模型。
　　 方法：
　　 1.完全免疫抗原的制備：
　　 1.1 豚鼠脊髓勻漿免疫抗原的制備取脊髓全長并稱重，按脊髓重量與冰鹽水體積為1：1、1：5、1：10三種比例制成

4、豚鼠脊髓勻漿，再與等量完全福氏佐劑充分混合，抽打制成油包水乳劑，即為完全免疫抗原。
　　 1.2 MBP69-85免疫抗原的制備MBP69-85以冰鹽水溶解，再與等體積完全福氏佐劑充分混合、抽打制成乳劑，即為完全免疫抗原。
　　 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及EAE模型誘導(dǎo):
　　 2.1 GPSCH-EAE實(shí)驗(yàn)組：Wistar大鼠60只，隨機(jī)均分為3組，分別以上述三種不同濃度脊髓勻漿抗原免疫，0.5ml/只，分別于四肢足墊

5、及背部五點(diǎn)皮下注射。對照組：Wistar大鼠10只，以完全福氏佐劑同法免疫。
　　 2.2 MBP69-85-EAE實(shí)驗(yàn)組：Wistar大鼠60只，隨機(jī)均分3組，分別以MBP69-85 25μg/只、MBP69-85 50μg/只、MBP69-85 100μg/只進(jìn)行免疫，按免疫乳劑0.5 mL/只分別于四肢足墊及背部五點(diǎn)皮下注射。對照組：Wistar大鼠10只，以完全福氏佐劑同法免疫。
　　 3.神經(jīng)功能評分：于免疫誘

6、導(dǎo)當(dāng)日及免疫后每天對動(dòng)物的體重變化、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況進(jìn)行觀察，并對動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能評分，采用Kono等提出的標(biāo)準(zhǔn)，分為5分：1 分動(dòng)物尾部無力；2 分尾部無力+肢體無力；3 分肢體輕度麻痹；4 分級肢體嚴(yán)重麻痹，被動(dòng)翻身后不能復(fù)原；5分瀕死狀態(tài)。
　　 4.組織病理學(xué)：各組大鼠均于免疫后50天內(nèi)按照發(fā)病、緩解、復(fù)發(fā)三個(gè)時(shí)期，以10％水合氯醛腹腔麻醉，生理鹽水及4％多聚甲醛（或多聚甲醛與戊二醛的混合液）經(jīng)左心室灌注固定，留取大腦

7、（視交叉層面2mm腦組織），小腦，延髓，頸膨大，腰膨大標(biāo)本，后固定于4％多聚甲醛中，常規(guī)石蠟包埋，6μm切片，組織切片行HE染色，三色染色及髓鞘堿性蛋白MBP、神經(jīng)微絲NF（neurofilament，NF）免疫組化染色。制備超薄切片，電鏡觀察髓鞘及軸索病理變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.勻漿抗原-EAE實(shí)驗(yàn)。
　　 1.1 勻漿的抗原1：1組：
　　 1.1.1 EAE大鼠的發(fā)病及臨床表現(xiàn)：大鼠的發(fā)病率

8、為60％，平均臨床癥狀評分為3.25±0.63，平均發(fā)病時(shí)間為14.25±1.66天，復(fù)發(fā)率為33.3％（1/3）。EAE大鼠于免疫后第12天開始發(fā)病，出現(xiàn)尾部肌張力減低、尾部無力，繼之出現(xiàn)后肢、進(jìn)而四肢無力、麻痹，大小便失禁，少數(shù)表現(xiàn)為僅雙前肢的無力或因病情危重而死亡。對照組大鼠沒有發(fā)病。
　　 1.1.2 組織病理學(xué)檢查：
　　 1.1.2.1 HE染色見：發(fā)病期，中樞神經(jīng)系統(tǒng)灰質(zhì)內(nèi)有單核、淋巴樣細(xì)胞彌漫或成簇浸潤，

9、在脊髓灰、白質(zhì)交界區(qū)內(nèi)小血管周圍可見由較多炎性細(xì)胞聚集形成典型血管“袖套樣”改變；癥狀緩解期，血管周圍浸潤細(xì)胞減少或消失；疾病復(fù)發(fā)期，血管周圍細(xì)胞增多，白、灰質(zhì)內(nèi)細(xì)胞浸潤明顯。
　　 1.1.2.2 三色染色可見軸突腫脹，呈串珠狀，且不連續(xù)，著色不均勻；髓鞘結(jié)構(gòu)層次紊亂，疏松，崩解；
　　 1.1.2.3 MBP及NF免疫組化染色顯示病變組織內(nèi)白質(zhì)脫髓鞘及軸突損傷。
　　 1.1.2.4 電鏡觀察：發(fā)病期病理改變

10、以髓鞘損傷為主，軸突腫脹、疏松；緩解期，受損髓鞘與相對完整髓鞘并存，軸突內(nèi)結(jié)構(gòu)模糊；復(fù)發(fā)期，軸突病變嚴(yán)重，空泡變甚至軸突消失。
　　 1.2 勻漿抗原1：5組：
　　 1.2.1 EAE大鼠的發(fā)病及臨床表現(xiàn)：EAE組大鼠的發(fā)病率為70％，平均臨床癥狀評分為1.68±0.93，平均發(fā)病時(shí)間16.07±4.25天，復(fù)發(fā)率為35.71％。EAE組大鼠于免疫后第12天開始發(fā)病，出現(xiàn)尾部無力，繼之出現(xiàn)后肢、四肢無力或麻痹，大小便失

11、禁，少數(shù)表現(xiàn)為僅雙前肢的無力或癱瘓以及斜頸、痙攣狀態(tài)等特殊類型臨床表現(xiàn)或因病情危重而死亡。對照組大鼠沒有發(fā)病。
　　 1.2.2 組織病理學(xué)檢查：
　　 1.2.2.1 HE染色見：發(fā)病期，中樞神經(jīng)系統(tǒng)灰質(zhì)內(nèi)有單核、淋巴樣細(xì)胞彌漫或成簇浸潤，在脊髓灰、白質(zhì)交界區(qū)內(nèi)小血管周圍可見由較多炎性細(xì)胞聚集形成典型血管“袖套樣”改變；癥狀緩解期，血管周圍浸潤細(xì)胞減少或消失；疾病復(fù)發(fā)期，血管周圍細(xì)胞增加，灰、白質(zhì)內(nèi)細(xì)胞浸潤明顯。

12、>　　 1.2.2.2 三色染色可見軸突腫脹，呈串珠狀，且不連續(xù)，著色不均勻；髓鞘結(jié)構(gòu)層次紊亂，疏松，崩解。
　　 1.2.2.3 MBP及NF免疫組化染色顯示病變組織內(nèi)白質(zhì)脫髓鞘及軸突損傷。
　　 1.2.2.4 電鏡觀察：發(fā)病期病理改變以髓鞘損傷為主，軸突腫脹、疏松；緩解期，受損髓鞘與相對完整髓鞘并存，軸突內(nèi)結(jié)構(gòu)模糊；復(fù)發(fā)期，軸突病變嚴(yán)重，空泡變甚至軸突消失。
　　 1.3 勻漿抗原1：10組：
　　

13、 1.3.1 EAE大鼠的發(fā)病及臨床表現(xiàn)：EAE組大鼠的發(fā)病率為50％，平均臨床癥狀評分為2.45±1.23，平均發(fā)病時(shí)間19.20±6.48天，復(fù)發(fā)率50％；EAE大鼠于免疫后第13開始發(fā)病，出現(xiàn)尾部無力，后肢、四肢無力、麻痹，大小便失禁，少數(shù)表現(xiàn)為僅雙前肢的無力或癱瘓以及斜頸、痙攣狀態(tài)或因病情危重而死亡。對照組大鼠沒有發(fā)病。
　　 1.3.2 組織病理學(xué)檢查：
　　 1.3.2.1 HE染色見：發(fā)病期，中樞神經(jīng)系統(tǒng)

14、灰質(zhì)內(nèi)有單核、淋巴樣細(xì)胞彌漫或成簇浸潤，在脊髓灰、白質(zhì)交界區(qū)內(nèi)小血管周圍可見由較多炎性細(xì)胞聚集形成典型血管“袖套樣”改變；癥狀緩解期，血管周圍浸潤細(xì)胞減少或消失；疾病復(fù)發(fā)期，血管周圍細(xì)胞增加，灰、白質(zhì)內(nèi)細(xì)胞浸潤明顯。
　　 1.3.2.2 三色染色見：軸突腫脹，呈串珠狀，且不連續(xù)，著色不均勻；髓鞘結(jié)構(gòu)層次紊亂，疏松，崩解。
　　 1.3.2.3 MBP及NF免疫組化染色顯示病變組織內(nèi)白質(zhì)脫髓鞘及軸突損傷。
　　

15、1.3.2.4 電鏡觀察：發(fā)病期病理改變以髓鞘破壞為主，軸突腫脹、疏松；緩解期，損傷髓鞘與相對完整髓鞘并存，軸突內(nèi)結(jié)構(gòu)模糊；復(fù)發(fā)期，軸突病變嚴(yán)重，空泡變甚至軸突消失。
　　 2.MBP69-85-EAE實(shí)驗(yàn)。
　　 2.1 EAE模型動(dòng)物的發(fā)病及臨床表現(xiàn)MBP69-85 50μg/只組內(nèi)大鼠發(fā)病率為30％，平均臨床癥狀評分為2.38±1.89；平均發(fā)病時(shí)間為13.83±1.47天，至處死時(shí)未再有復(fù)發(fā)。EAE大鼠在免疫后第

16、12天發(fā)病，出現(xiàn)尾部張力減低、尾部無力，繼之出現(xiàn)后肢、進(jìn)而四肢無力、麻痹，大小便失禁，或表現(xiàn)為斜頸（占發(fā)病大鼠的1/3）、因病情危重而死亡，其余各組未見發(fā)病。
　　 2.2 組織病理學(xué)觀察：
　　 2.2.1 HE染色EAE模型組急性發(fā)病期中樞神經(jīng)系統(tǒng)灰質(zhì)內(nèi)有單核、淋巴樣細(xì)胞彌漫或成簇浸潤，在腦或脊髓灰、白質(zhì)交界區(qū)內(nèi)小血管周圍可見由較多炎性細(xì)胞聚集形成典型血管“袖套樣”改變。
　　 2.2.2 三色染色可見軸突

17、腫脹，呈串珠狀，且不連續(xù)，著色不均勻；髓鞘“板層樣”結(jié)構(gòu)層次紊亂，疏松，崩解。
　　 2.2.3 MBP及NF免疫組化染色顯示病變組織內(nèi)白質(zhì)脫髓鞘及軸突損傷。
　　 結(jié)論：
　　 1.EAE大鼠的發(fā)病在一定程度上不依賴于免疫抗原量的大小，在某一合適劑量范圍內(nèi)的抗原均可誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病。EAE動(dòng)物的發(fā)病表現(xiàn)具有多樣性和特異性，據(jù)神經(jīng)系統(tǒng)受損部位的不同而出現(xiàn)不同的表現(xiàn)。
　　 2.EAE動(dòng)物的臨床表現(xiàn)與其病理

18、改變并不一致，提示神經(jīng)功能可能存在多種代償?shù)臋C(jī)制。在EAE動(dòng)物首次發(fā)病時(shí)，髓鞘病理改變的嚴(yán)重程度與免疫抗原的劑量有關(guān)系。在EAE的病理改變過程中，髓鞘破壞與髓鞘再生并存，而軸突病變是一個(gè)持續(xù)進(jìn)展、逐漸加重的過程。
　　 3.MBP69-85含有特異性致炎因子，具有致腦脊髓炎作用。EAE模型建立與免疫抗原MBP69-85的量有一定的依賴關(guān)系，需要要合適劑量的免疫抗原觸發(fā)適當(dāng)強(qiáng)度的自身免疫反應(yīng)才可使EAE大鼠發(fā)病。
　　 4