多發(fā)性硬化的蛋白質(zhì)組學(xué)和病理學(xué)研究.pdf

1、目的： 探索多發(fā)性硬化的分子機(jī)制并尋找該疾病腦脊液、血清的蛋白質(zhì)標(biāo)志物以及了解該蛋白質(zhì)在EAE動(dòng)物模型脊髓中的異常表達(dá)，探討其在MS的發(fā)病機(jī)制以及修復(fù)機(jī)制中的作用，為藥物療效觀察提供實(shí)驗(yàn)資料。 方法： 1．緊張型頭痛患者腦脊液樣本經(jīng)超濾濃縮并除鹽、以ProteoExtractAlbumin/IgG Removal Kit試劑盒去除高豐度蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，雙向凝膠電泳，硝酸銀染色以及考馬斯亮藍(lán)

2、染色，應(yīng)用ImageMaster2DPlatinum5.0軟件分析凝膠圖譜圖像，尋找差異性蛋白點(diǎn)，與SWISS-2DPAGE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將感興趣的蛋白點(diǎn)切下，經(jīng)膠內(nèi)酶切，以肽質(zhì)量指紋質(zhì)譜技術(shù)鑒定，利用MASCOT軟件和NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索并鑒定蛋白質(zhì)。 2．按建立的腦脊液蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)體系，多發(fā)性硬化患者與緊張型頭痛患者各6例的腦脊液進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。鑒定和分析差異性蛋白質(zhì)點(diǎn)。 3．健康受試者血清樣本

3、經(jīng)除鹽、去除高豐度蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，雙向凝膠電泳，硝酸銀染色以及考馬斯亮藍(lán)染色，應(yīng)用ImageMaster2DPlatinum5.0軟件分析凝膠圖譜圖像，尋找差異性蛋白點(diǎn)，與SWISS-2DPAGE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，將感興趣的蛋白點(diǎn)切下，經(jīng)膠內(nèi)酶切，以肽質(zhì)量指紋質(zhì)譜技術(shù)鑒定，利用MASCOT軟件和NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索蛋白質(zhì)。 4．按建立的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)體系，多發(fā)性硬化患者與健康受試者各8例的血清

4、進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究。鑒定和分析差異性蛋白質(zhì)點(diǎn)。 5．應(yīng)用豚鼠全脊髓勻漿(GPSCH)加福氏完全佐劑皮下注射免疫Wistar大鼠，觀察其臨床癥狀以及病理學(xué)改變，建立EAE的Wistar大鼠動(dòng)物模型。 6．EAE動(dòng)物模型的各段脊髓經(jīng)取材，包埋，切片，以二步法免疫組織化學(xué)染色，觀察APOE在各段脊髓灰白質(zhì)內(nèi)的表達(dá)；以SP法免疫組織化學(xué)染色，觀察膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)在各段脊髓灰白質(zhì)內(nèi)的表達(dá)。 結(jié)果：

5、1．硝酸銀染色：可檢測(cè)到316個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)；考馬斯亮藍(lán)染色：可檢測(cè)到201個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)；蛋白電泳凝膠的重復(fù)性研究，兩次銀染的匹配率為93.2％，通過(guò)對(duì)任選的30個(gè)匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)的pI值和MW值比較，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，技術(shù)體系的重復(fù)性良好。 2.38種蛋白質(zhì)的表達(dá)在多發(fā)性硬化患者與對(duì)照組顯著差異，部分差異性蛋白質(zhì)經(jīng)鑒定為白蛋白單體CRA_n、ATP合成酶、普通轉(zhuǎn)錄因子IIH、白蛋白單體CRA_j、四連接素、結(jié)合珠蛋白、叢生蛋白、富亮氨酸

6、α-2糖蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白、甲狀腺結(jié)合蛋白。 3．硝酸銀染色：可檢測(cè)到233個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)；考馬斯亮藍(lán)染色：可檢測(cè)到168個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)；蛋白電泳凝膠的重復(fù)性研究，兩次銀染的匹配率為94.6％，通過(guò)對(duì)任選的30個(gè)匹配蛋白質(zhì)點(diǎn)的pI值和MW值比較，結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，技術(shù)體系的重復(fù)性良好。 4.23種蛋白質(zhì)的表達(dá)量在多發(fā)性硬化患者與對(duì)照組顯著差異，部分差異性蛋白質(zhì)經(jīng)鑒定為載脂蛋白E、絲氨酸蛋白酶抑制因子A1、白蛋白A鏈、a-1酸性

7、糖蛋白1、α-1微糖蛋白、叢生蛋白、結(jié)合珠蛋白、富亮氨酸α-2糖蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白、甲狀腺結(jié)合蛋白。 5．EAE組發(fā)病率100％，發(fā)病時(shí)間為免疫后(14.1±2.6)天，呈慢性單相病程；HE染色見(jiàn)EAE組大腦、小腦、腦干以及脊髓組織大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，血管周?chē)纬裳准?xì)胞袖套，脊髓的病理改變嚴(yán)重，其中以白質(zhì)與灰白質(zhì)交界區(qū)域?yàn)橹?；Luxol fast blue染色見(jiàn)EAE組脊髓白質(zhì)脫髓鞘改變。對(duì)照組無(wú)上述病理改變。 6．EA

8、E組炎性細(xì)胞聚集在血管周?chē)纬尚涮讟痈淖?，其血管周邊APOE免疫反應(yīng)陽(yáng)性明顯；對(duì)照組無(wú)上述病理改變。白質(zhì)區(qū)域中的APOE免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞明顯多于對(duì)照組?；屹|(zhì)區(qū)域中的APOE免疫反應(yīng)強(qiáng)于對(duì)照組。陰性對(duì)照均未見(jiàn)DAB染色。GFAP染色提示白質(zhì)中APOE染色陽(yáng)性細(xì)胞大部分來(lái)源于星形細(xì)胞。 結(jié)論： 多發(fā)性硬化患者腦脊液、血清中多種蛋白質(zhì)表達(dá)差異，可能存在能量代謝異常、炎癥反應(yīng)和組織修復(fù)機(jī)制；其中APOE在EAE中表達(dá)異常，反映星