胚胎基底前腦細胞移植海馬后Nestin陽性神經(jīng)元的生長發(fā)育.pdf

1、基底前腦(basal forebrain，BF)是指位于端腦和間腦內(nèi)側(cè)和腹側(cè)部的一些灰質(zhì)結(jié)構(gòu)。其中隔一斜角帶(MS-DBB)復合體存在大量的膽堿能神經(jīng)元。有研究表明，基底前腦膽堿能系統(tǒng)與學習記憶密切有關。Alzheimer病(Alzheimer's disease，AD)與基底前腦膽堿能神經(jīng)元的嚴重丟失有關。 Nestin屬于中間絲蛋白家族，由于其主要在胚胎期和成年的神經(jīng)前體細胞表達的特性，自發(fā)現(xiàn)以來，一直被視為神經(jīng)前體細胞的標

2、志物。然而，本實驗室觀察到在成年大鼠和人基底前腦存在Nestin陽性細胞，這些Nestin陽性細胞表達神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)，并且不與膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)共存，提示這些Nestin陽性細胞為神經(jīng)元。Nestin陽性神經(jīng)元于生后第11天在基底前腦開始出現(xiàn)，并且衰老和老年學習記憶減退大鼠Nestin陽性神經(jīng)元明顯減少，提示Nestin陽性神經(jīng)元可能與學習記憶有關。 目的： 本研究的目的在于：探討基底前腦Ne

3、stin陽性神經(jīng)元的起源以及進一步了解它和膽堿能神經(jīng)元的關系；觀察Nestin陽性神經(jīng)元和ChAT陽性神經(jīng)元移植后的生長發(fā)育。本研究的結(jié)果將為進一步探討Nestin陽性神經(jīng)元的特性和功能提供資料和線索。 材料和方法： 雄性3個月齡健康成年Sprague-Dawlcy(SD)大鼠(中山大學醫(yī)學實驗動物中心提供)55只，體重200～250g。隨機分為3組：(1)單純細胞移植組：移植存活15天、1個月、2個月、3個月，共4小組

4、，每小組7只，共28只。(2)對照組(D-Hanks液)：移植存活15天、1個月、2個月、3個月，共4小組，每小組5只，共20只。(3)單側(cè)穹窿海馬傘(fimbria-fomix，F(xiàn)F)切斷術+細胞移植組：移植存活2個月，共7只。應用細胞培養(yǎng)技術制作胚胎基底前腦細胞懸浮液；通過立體大腦定位儀進行單側(cè)FF切斷手術；把細胞懸浮液(對照組用D-Hanks液)移植到相應各組成年大鼠海馬內(nèi)；存活到相應時間點，動物經(jīng)4％的多聚甲醛常規(guī)灌注固定后，取

5、腦作冰凍切片，應用免疫組織化學和免疫熒光雙標染色方法，觀察移植物Nestin陽性神經(jīng)元和ChAT陽性神經(jīng)元的表達情況，并進行細胞計數(shù)和統(tǒng)計學分析。 結(jié)果： 1.移植物存活部位 移植物大多數(shù)生長在海馬和齒狀回，部分移植物在海馬以及周圍的裂隙內(nèi)，如齒狀回與CA1區(qū)之間的海馬裂內(nèi)，或者胼胝體下的海馬槽內(nèi)。少量移植物在針道(皮質(zhì)和胼胝體內(nèi))良好存活。 2.單純細胞移植組移植物內(nèi)Nestin陽性神經(jīng)元和ChAT陽性

6、神經(jīng)元的生長發(fā)育 移植物存活15天就有Ncstin陽性神經(jīng)元的表達，移植物內(nèi)的Ncstin神經(jīng)元體積較小，細胞核較大，胞漿較少或很少，染色深，細胞突起較短或無明顯突起。 存活1個月組，Nestin陽性神經(jīng)元的體積增大，胞漿增多，細胞突起仍不太明顯，移植物中見到少數(shù)的ChAT陽性細胞神經(jīng)元，胞體完整，呈卵圓形，無突起，染色較深。 移植物存活2個月后，Nestin陽性神經(jīng)元形態(tài)較為成熟，可見胞體呈卵圓形或多級型，部分

7、神經(jīng)元不發(fā)出突起；少數(shù)細胞胞體發(fā)出初級突起，見于移植團塊周邊或遷移到團塊外的神經(jīng)元。ChAT陽性神經(jīng)元胞體大小無明顯變化，呈卵圓形或梭形，可見明顯細胞突起，突起短粗。 直到移植后3個月，Nestin陽性神經(jīng)元細胞形態(tài)趨于成熟，胞體飽滿，多呈雙極型，染色均勻，突起較長，常有1～3支突起。ChAT陽性神經(jīng)元胞體明顯變大，胞體成熟，突起很長。各個時間點ChAT陽性神經(jīng)元胞體均比Nestin陽性神經(jīng)元胞體體積稍大。數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，移植

8、后1、2和3個月各組的Nestin陽性神經(jīng)元密度均大于相應時間點ChAT陽性神經(jīng)元(P<0.01)。各組間Nestin陽性神經(jīng)元密度無明顯差異(P>0.05)。移植后3個月組ChAT陽性神經(jīng)元密度小于移植后1個月(P<0.05)、2個月組(P<0.01)；移植后1個月、2個月組無明顯差異(P>0.05)。 3.移植對照組(D-Hanks液)Nestin免疫組織化學結(jié)果 移植后15天組可以觀察到移植液與宿主海馬之間并無清晰

9、的邊界輪廓，大多在海馬裂上呈帶狀分布，周圍可見大量的Nestin陽性的反應性星形膠質(zhì)細胞，胞體較小，具有細小、較長而直的胞突，未發(fā)現(xiàn)具有神經(jīng)元形態(tài)的Nestin陽性細胞；移植后1個月組，移植液周圍仍然有Nestin陽性的膠質(zhì)細胞，但較15天組已明顯減少；移植后2、3個月組Nestin陽性的膠質(zhì)細胞幾乎消失。 4.單側(cè)FF切斷術+細胞移植組 移植物內(nèi)Nestin陽性神經(jīng)元和ChAT陽性神經(jīng)元的生長發(fā)育單側(cè)FF切斷術移植組存

10、活2個月后，可見移植物內(nèi)有較多的Nestin陽性神經(jīng)元，根據(jù)其胞體大小、分布和樹突分支分為兩組。一組胞體呈卵圓形，由胞體發(fā)出1～2支較粗的初級樹突，其直徑逐漸減小，也有少部分神經(jīng)元不發(fā)出突起。另一組胞體較第一組的大，大多呈雙極或多極形，常有1～3支突起，其分支較第一組的多。移植物內(nèi)ChAT陽性神經(jīng)元數(shù)量較多，細胞突起長，纖維豐富，染色深，胞體成熟，胞體體積稍大于Nestin陽性神經(jīng)元。 數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示，單側(cè)FF切斷術+細胞移植

11、組移植物Nestin陽性神經(jīng)元密度大于ChAT陽性神經(jīng)元(P<0.01)；其生長體積以及Nestin陽性神經(jīng)元和ChAT陽性神經(jīng)元密度要大于單純細胞移植后2個月組(P<0.01)。 結(jié)論： 1.胚胎基底前腦細胞移植到海馬后有Nestin陽性神經(jīng)元存活，并隨時間點的延長能得到良好的發(fā)育和生長。可推斷基底前腦生后11天出現(xiàn)的Nestin陽性神經(jīng)元是由本區(qū)細胞的原位再表達，而并非是從其它腦區(qū)遷移后發(fā)育而來。 2.單側(cè)F

12、F切斷術+細胞移植后2個月組移植物生長體積、Nestin陽性神經(jīng)元以及ChAT陽性神經(jīng)元密度均大于單純細胞移植后2個月組，表明單側(cè)FF切斷術后去神經(jīng)支配的海馬比正常海馬提供了更加良好的微環(huán)境使移植的胚胎基底前腦細胞更好地分化為成熟Nestin陽性神經(jīng)元和ChAT陽性神經(jīng)元。 3.胚胎基底前腦細胞移植到海馬后各移植組的Nestin陽性神經(jīng)元密度均大于相應時間點ChAT陽性神經(jīng)元，表明Nestin陽性神經(jīng)元移植后較ChAT陽性神經(jīng)元