白三烯抑制劑拮抗博萊霉素所致大鼠肺纖維化機(jī)制的探討.pdf

1、間質(zhì)性疾病是以肺組織炎癥細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)與膠原進(jìn)行性積聚為病理特征，最終取代正常肺組織結(jié)構(gòu)而嚴(yán)重影響肺功能、臨床預(yù)后較差的一類疾病，以特發(fā)性肺纖維化較為常見。但其發(fā)病機(jī)制仍不明，臨床治療缺乏有效方法。近年，我們采用白三烯抑制劑(leukotriene inhibitor，LTI)進(jìn)行防治肺纖維化的實(shí)驗(yàn)研究，已明確LTI可延緩或抑制肺纖維化，但其機(jī)制尚不清楚，限制了LTI在臨床的應(yīng)用發(fā)展。本研究在我們過去的研究結(jié)果基礎(chǔ)

2、上，采用經(jīng)典的氣管內(nèi)滴注博萊霉素誘導(dǎo)大鼠肺纖維化的方法復(fù)制肺纖維化動(dòng)物模型，以LTI齊留通進(jìn)行干預(yù)，探討LTI拮抗博萊霉素所致大鼠肺纖維化形成的可能機(jī)制，為其進(jìn)一步在臨床的應(yīng)用提供機(jī)制方面研究的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一章白三烯抑制劑對肺纖維化的拮抗效應(yīng)。
　　 目的：采用氣管內(nèi)滴注博萊霉素的方法制備大鼠肺纖維化模型、給予LTI齊留通對大鼠肺纖維化的形成進(jìn)行干預(yù)，進(jìn)一步觀察大鼠動(dòng)物模型肺纖維化形成過程中肺泡炎及肺纖維化的程度

3、變化和LTI的干預(yù)效應(yīng)。
　　 方法：72只SD雄性大鼠隨機(jī)數(shù)字法分為正常對照組(C組)、博萊霉素模型組(B組)和LTI處理組(T組)，每組動(dòng)物24只。B組和T組大鼠均采用氣管內(nèi)滴注BLMA5(5mg/kg)復(fù)制肺纖維化動(dòng)物模型，T組動(dòng)物于造模當(dāng)天始從胃管內(nèi)灌入齊留通溶液(100mg/kg/d)，B組動(dòng)物以生理鹽水0.5ml/100g/d灌胃作為T組動(dòng)物的干預(yù)對照；C組動(dòng)物的處置與B組和T組動(dòng)物的模型復(fù)制過程相同，但以等量生理鹽

4、水代替博萊霉素于氣管內(nèi)注入，且以等量生理鹽水代替齊留通溶液灌胃。各組動(dòng)物均在制模開始后第7d、14d、28d分別隨機(jī)處死8只動(dòng)物，取左肺下葉組織制作臘塊行病理切片HE染色和Masson染色，顯微鏡下觀察肺泡炎和肺纖維化程度，堿水解法檢測肺組織羥脯氨酸濃度，免疫組化技術(shù)檢測大鼠肺組織α-SMA水平。
　　 結(jié)果：(1)肺系數(shù)：B組在氣管內(nèi)滴注博萊霉素后肺系數(shù)各觀察時(shí)間點(diǎn)均明顯高于C組(p<0.01)，T組動(dòng)物在LTI干預(yù)后在各觀察

5、時(shí)間點(diǎn)均較B組下降(p<0.05)。(2)肺組織肺泡炎程度(HE染色)評分：C組在各觀察時(shí)間點(diǎn)評分均低；B組較C組在各觀察時(shí)間點(diǎn)評分均增高(第7天和第14天均p<0.01，第28天p<0.05)；T組在各觀察時(shí)間點(diǎn)評分均較B組為低(p<0.05)，但較C組仍高(p<0.05)。(3)肺組織肺纖維化程度(Masson染色)評分：C組在各觀察時(shí)間點(diǎn)評分均低；B組與C組相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)評分均有增高(第7天p<0.05，第14天和第28天均p

6、<0.01)；T組在第14天和第28天的評分均較B組為低(p<0.05和p<0.01)，但在各觀察時(shí)間點(diǎn)的評分仍高于C組(p<0.05)。(4)肺組織羥脯氨酸(Hyp)含量：制模后第7天，三組動(dòng)物的含量在各觀察時(shí)間點(diǎn)均無顯著性差異(p>0.05)；第14天和第28天B組均較C組增高(p<0.01)；第14天T組較B組減低(p<0.05)，第28天T組較B組減低更明顯(p<0.025)。(5)肺組織α-SMA蛋白的表達(dá)：B組和T組與C組相

7、比，第7天表達(dá)水平無明顯差異；第14天和第28天B組較C組表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)；T組在第14天和第28天均較B組減弱(分別p<0.05和<0.01)，但表達(dá)仍較C組為強(qiáng)(P<0.01)。
　　 結(jié)論：1.BLM氣管內(nèi)滴注可成功復(fù)制大鼠肺纖維化動(dòng)物模型。2.白三烯參與大鼠肺纖維化動(dòng)物模型形成過程中早期肺泡炎的產(chǎn)生和后期肺纖維化的形成。3.LTI可降低肺纖維化大鼠肺組織勻漿中羥脯氨酸的含量、降低大鼠肺纖維化模型肺組織的膠原代

8、謝、減輕大鼠肺纖維化模型形成過程中早期肺泡炎和后期肺纖維化的程度。
　　 第二章白三烯抑制劑對肺纖維化TH1/TH2類細(xì)胞因子的作用。
　　 目的：觀察TH1和TH2細(xì)胞的特征性細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4在博萊霉素所致大鼠肺纖維化形成過程中肺組織中的變化，探討LTI對IFN-γ和IL-4的影響，觀察LTI有無調(diào)節(jié)TH1/TH2細(xì)胞因子失衡作用。
　　 方法：博萊霉素所致大鼠肺纖維化模型的制備和LTI的干預(yù)步驟和

9、方法同第一部分。取C組、B組和T組大鼠右肺凍存于-70℃冰箱備用。檢測時(shí)取肺組織制成勻漿，低溫離心后取上清液按照ELISA試劑盒使用說明檢測肺組織Cys-LTs、LTB4、IL-4和INF-γ的濃度。
　　 結(jié)果：1.肺組織cys-LTs含量：B組與C組肺組織中Cys-LTs含量相比，各觀察時(shí)間點(diǎn)的含量均有增高(p值均<0.001)，以第7天含量最高，第28天含量最低；T組較B組含量在各觀察時(shí)間點(diǎn)相比均有降低，第7天相比和第28

10、天相比均有降低(p<0.05)，第14天相比有顯著降低(p<0.025)，但T組與C組含量相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)仍有顯著增高(第7天相比p<0.001，第14天相比p<0.005，第28天相比p<0.05)。2.肺組織LTB4含量：B組含量在各觀察時(shí)間點(diǎn)與C組含量相比均明顯增高(p<0.001)；T組與B組相比，各觀察時(shí)間點(diǎn)的肺組織中LTB4含量均顯著降低，以第7天和第14天降低最顯著(p<0.005)，第28天相比也明顯降低(p<0.02

11、5)；但T組與C組相比含量仍有增高，以第7天和第14天相比增高較顯著(p值均<0.001)，在第28天相比稍有增高(p值<0.05)。3.肺組織INF-γ(Elisa結(jié)果)濃度：B組較C組相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)均有降低，以第28天下降最明顯(p值均<0.001)；T組較B組相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)均有增高，以第7天和第28天時(shí)增高較為明顯(分別p<0.005和p<0.001)，第14天相比稍有增高(p<0.05)。但在各觀察時(shí)間點(diǎn)相比均仍高于C組

12、，以第14天和第28天含量差異較為明顯(p<0.005和p<0.001)。4.肺組織IL-4(Elisa結(jié)果)濃度：B組第7天即開始增高，至第28天含量最高，與C組相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)均顯著增高(均p<0.001)；T組與B組相比各觀察時(shí)間點(diǎn)含量均顯著降低(p<0.005)，但仍高于C組，以第14天(p<0.005)和第28天較明顯(p<0.001)。
　　 結(jié)論：
　　 1.LTI可減少博萊霉素所致大鼠肺纖維化動(dòng)物模型肺

13、組織勻漿中Cys-LTs、LTB4的含量。
　　 2.LTI可增高博萊霉素所致大鼠肺纖維化動(dòng)物模型肺組織勻漿中TH1細(xì)胞因子INF-γ增高和TH2細(xì)胞因子IL-4。
　　 3.LTI可能通過調(diào)整TH1/TH2細(xì)胞因子的平衡減輕肺纖維化早期肺泡炎的程度。
　　 第三章 LTI對肺纖維化時(shí)TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子Smads蛋白表達(dá)的影響。
　　 目的：采用原位雜交技術(shù)，觀察TGF-β1、Smad3、Smad4、

14、Smad7在博萊霉素所致大鼠肺纖維化模型肺纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)變化，探討LTI對上述信號蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法：博萊霉素所致大鼠肺纖維化模型的制備和LTI的干預(yù)步驟和方法同第一部分。取C組、B組和T組大鼠左肺下葉組織制作臘塊并切片，采用鏈霉素親和素-過氧化物酶(SABC)法免疫組化染色檢測TGF-β的表達(dá)。
　　 結(jié)果：1.肺組織TGF-β1的表達(dá)結(jié)果：第7天、第14天和第28天的表達(dá)B組和T組均較C組明顯為

15、強(qiáng)(p<0.001)，以第7天的表達(dá)最為明顯，且個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)T組均較B組為弱(p<0.05)。2.肺組織中Smad2/3的表達(dá)：多在巨噬細(xì)胞、肺Ⅱ型上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和增生細(xì)支氣管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)；C組動(dòng)物肺組織Smad3的表達(dá)在第7、第14和第28天三個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)均無明顯變化；B組動(dòng)物與C組動(dòng)物相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)肺組織Smad3的表達(dá)均有增高，且在第7天即有增高(p<0.005)，第14天表達(dá)增高最明顯(p<0.001)；T

16、組較B組相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均有減低(p<0.05)，但仍高于C組在各觀察時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)(均p<0.05)。3.肺組織Smad4的表達(dá)：與Smad2/3的表達(dá)情況類似，Smad4多表達(dá)在巨噬細(xì)胞、肺Ⅱ型上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和增生細(xì)支氣管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)；B組在各觀察時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均明顯高于C組(P<0.001)，T組與B組相比在各觀察時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均明顯降低(p<0.05)，但仍顯著高于C組(P<0.005)。4.肺組織Smad7的表達(dá)：與

17、Smad2/3和Smad4的表達(dá)情況相反，多在巨噬細(xì)胞、肺Ⅱ型上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和增生細(xì)支氣管上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)；B組在各觀察時(shí)間點(diǎn)與C組相比均顯著低于C組(P<0.001)，第7天即減低，第14天表達(dá)最低，第28天又明顯增高；T組的表達(dá)在第7、14和28天均較B組的表達(dá)有所增高(均P<0.05)，然而在各觀察時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)仍低于C組(P≤0.005)。
　　 結(jié)論：
　　 1.博萊霉素所致大鼠肺纖維化動(dòng)物模型肺組織

18、內(nèi)TGF-β1的表達(dá)增強(qiáng)，LTI可減低博萊霉素所致大鼠肺纖維化動(dòng)物模型肺組織TGF-β1的表達(dá)。
　　 2.博萊霉素所致大鼠肺纖維化動(dòng)物模型肺組織的巨噬細(xì)胞、肺Ⅱ型上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和增生的細(xì)支氣管上皮細(xì)胞胞漿內(nèi)R-Smad(Smad3)和Co-Smad(Smad4)的表達(dá)增強(qiáng)而細(xì)胞核內(nèi)I-Smad(Smad7)的表達(dá)減低，LTI可減低上述細(xì)胞胞漿內(nèi)R-Smad(Smad3)和Co-Smad(Smad4)的表達(dá)增強(qiáng)并增強(qiáng)上述細(xì)