黃芪維持氧化-抗氧化平衡抑制博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化.pdf

1、目的：
　　本研究通過氣道內霧化博萊霉素制作肺纖維化小鼠模型，對黃芪治療后的小鼠肺組織行HE和Masson染色，測定黃芪治療后小鼠血清丙二醛(Malondialdehyde，MDA)MDA/總抗氧化能力(Tatol Anti-oxidant，T-AOC)比值、肺組織NADPH氧化酶2/4(NADPH Oxidase，Nox2/4)、超氧化物歧化酶1/2/3(Superoxide Dismutase，SOD1/2/3)、過氧化氫酶(

2、Catalase，CAT) mRNA及NOX2/4蛋白表達水平探討黃芪減輕肺纖維化的可能機制。該研究可能為我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥黃芪在肺纖維化治療中的應用提供可供參考的實驗基礎，產(chǎn)生一定的社會價值和經(jīng)濟價值。
　　方法:
　　1.黃芪緩解博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化
　　將8周齡的雌性SPF級昆明小鼠隨機平均分為3組，對照組、博萊霉素組、黃芪治療組，并做以下處理:使用MicroSprayereTM霧化器吸取100ul博萊霉素溶液

3、（3mg/kg溶于100ul生理鹽水），將霧化器針頭從聲門插入小鼠氣道，緩慢進行霧化，對照組的小鼠霧化相同體積的生理鹽水，黃芪治療組小鼠在氣管內霧化博萊霉素后，每日腹腔注射100ul的黃芪注射液（1.7g/kg稀釋至100ul），對照組和博萊霉素組小鼠每日腹腔注射相同體積的生理鹽水。造模的第14天處死各組小鼠，解剖各組小鼠，獲取肺組織標本。將各組小鼠的肺組織浸泡在10％中性甲醛中進行固定，48h后，取出肺組織進行石蠟包埋，切片后行HE和

4、Masson染色，然后參照Mikawar[13]和Ashcroft[14]法對肺組織進行炎癥損傷和纖維化損傷評分。各組小鼠肺組織用勻漿器勻漿后分別提取總RNA和總蛋白，RT-PCR法測定α平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）的轉錄水平，Westernblotting檢測α-SMA的表達水平。
　　2.黃芪對博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠總體MDA/T-AOC的影響
　　將8周的齡雌性SPF級昆明

5、小鼠隨機平均分為3組，對照組、博萊霉素組、黃芪治療組，處理同上。造模的第14天處死各組小鼠，眼球取血法獲得小鼠全血標本，3000轉/分離心10分鐘獲得血清，嚴格按照南京建成生物工程研究所研制的MDA試劑盒和T-AOC試劑盒的說明書進行檢測，測定各組小鼠血清MDA和T-AOC水平。
　　3.黃芪對博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠氧化相關基因的影響
　　將8周齡的雌性SPF級昆明小鼠隨機平均分為3組，對照組、博萊霉素組、黃芪治療組，處

6、理同上。造模的第14天處死各組小鼠，解剖小鼠，獲得肺組織標本。各組小鼠肺組織用勻漿器勻漿，然后分別提取其總RNA和總蛋白，RT-PCR法測定NOX2、NOX4的轉錄水平，Western blotting檢測NOX2、NOX4的表達水平。
　　4.黃芪對博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠抗氧化相關基因的影響
　　將8周齡的雌性SPF級昆明小鼠隨機平均分為3組，對照組、博萊霉素組、黃芪治療組，處理同上。造模的第14天處死各組小鼠，解剖小

7、鼠，獲得肺組織標本。各組小鼠肺組織用勻漿器勻漿，然后分別提取總RNA，RT-PCR法測定SOD1/2/3，CAT mRNA的轉錄水平。
　　結果:
　　1.黃芪緩解博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化
　　1.1 肺組織HE染色:對照組小鼠肺組織結構清晰，肺泡壁較薄，肺泡重無明顯紅細胞及炎細胞的浸潤;博萊霉素組小鼠肺組織出現(xiàn)彌漫性肺實變，肺泡壁明顯增厚，肺泡中有大量的炎細胞及少量紅細胞的浸潤，肺間質有較多成纖維細胞;黃芪治療組小

8、鼠炎癥損傷程度居于對照組小鼠及博萊霉素組小鼠之間。參照Mikawar法進行炎癥損傷評分。三組小鼠肺組織炎癥損傷評分依次為1.50±1.73、7.75±0.96、4.5±0.58，博萊霉素組小鼠炎癥損傷評分較對照組明顯升高(P＜0.01)，黃芪治療組小鼠炎癥損傷評分較對照組明顯升高(P＜0.01)，但較博萊霉素組明顯下(P＜0.01)。
　　1.2 肺組織Masson染色:對照組小鼠肺組織肺泡結構相對完整，無明顯的炎細胞浸潤，無明顯

9、膠原纖維沉積;博萊霉素組小鼠肺組織結構較為紊亂，肺泡的結構消失，出現(xiàn)大片彌漫性纖維化病灶和炎癥細胞浸潤，組織間可見大量藍色膠原纖維沉積;黃芪組小鼠肺組織結構基本完整，肺泡壁輕中度增厚，有少量的炎癥細胞浸潤和藍色膠原纖維的沉積。參照Ashcroft法進行纖維化損傷評分。三組小鼠肺組織纖維化損傷評分依次為1.50±0.58、7.25±0.50、3.25±0.50，博萊霉素組小鼠的纖維化損傷評分較對照組明顯升高(P＜0.01)，黃芪治療組小鼠

10、纖維化損傷評分較對照組明顯升(P＜0.01)，但較博萊霉素組明顯下降(P＜0.01)。
　　1.3 小鼠肺組織α-SMA mRNA轉錄水平:博萊霉素組小鼠肺組織α-SMAmRNA轉錄水平較對照組顯著升高（1.33±0.07 VS0.99±0.04，P＜0.01），黃芪治療組小鼠肺組織α-SMA mRNA轉錄水平較博萊霉素組顯著降低（0.99±0.05 VS1.33±0.07，P＜0.01），黃芪治療組小鼠肺組織α-SMA mRNA

11、轉錄水平與對照組無顯著性差異（0.99±0.05 VS0.99±0.04，P=1.00）。
　　2.黃芪對博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠總體MDA/T-AOC的影響
　　2.1 小鼠血清MDA水平:博萊霉素組小鼠血清MDA較對照組顯著升高（282.54±6.93 VS9.88±0.83，P＜0.01），黃芪治療組小鼠MDA較博萊霉素組小鼠顯著降低（9.02±2.89 VS282.54±6.93，P＜0.01），與對照組無顯著性差

12、異(9.02±2.89 VS9.88±0.83 P=0.788)。
　　2.2 小鼠血清T-AOC水平:博萊霉素組小鼠血清T-AOC較對照組顯著升高（15.01±1.06 VS9.44±1.26，P＜0.01），黃芪治療組小鼠T-AOC較對照組小鼠顯著升高（13.01±1.70 VS9.44±1.26，P＜0.01），與博萊霉素組無顯著性差異(13.01±1.70 VS15.01±1.06 P=0.068)。
　　2.3 小

13、鼠血清MDA/T-AOC水平:博萊霉素組小鼠血清MDA/T-AOC值較對照組顯著升高（18.90±1.52 VS1.06±0.17，P＜0.01），黃芪治療組小鼠MDA/T-AOC較博萊霉素組小鼠顯著降低（0.69±0.20 VS18.90±1.52，P＜0.01），與對照組無顯著性差異（0.69±0.20 VS1.06±0.17，P=0.575）。
　　3.黃芪對博萊霉素誘導的肺纖維化小鼠氧化相關基因的影響
　　3.1 小

14、鼠肺組織NOX2 mRNA轉錄情況:博萊霉素組小鼠肺組織NOX2mRNA轉錄水平較對照組顯著升高（1.31±0.14 VS0.88±0.09，P＜0.01），黃芪治療組小鼠肺組織NOX2 mRNA轉錄水平較博萊霉素組和對照組明顯下降(0.56±0.05 VS1.31±0.14,P＜0.01;0.56±0.05 VS0.88±0.09,P＜0.01)。
　　3.2 小鼠肺組織NOX4 mRNA轉錄情況:博萊霉素組小鼠肺組織NOX4m

15、RNA轉錄水平較對照組顯著升高（1.26±0.01 VS1.16±0.02，P＜0.05），黃芪治療組小鼠肺組織NOX4 mRNA轉錄水平較博萊霉素組和對照組明顯下降(0.71±0.08 VS1.26±0.01,P＜0.01;0.71±0.08 VS1.16±0.02,P＜0.01)。
　　3.3 小鼠肺組織NOX2蛋白表達情況:博萊霉素組小鼠肺組織NOX2蛋白表達水平較對照組顯著升高（0.41±0.01 VS0.17±0.01，

16、P＜0.01），黃芪治療組小鼠肺組織NOX2蛋白表達水平較博萊霉素組明顯下降(0.17±0.03 VS0.41±0.01，P＜0.01)，較對照組無顯著性差異(P=0.839)。
　　結論:
　　黃芪具有顯著的抗氧化作用，它對博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化有一定的緩解作用。黃芪的抗纖維化機制可能與遏制博來霉素所導致的結構細胞氧化損傷，維持機體的氧化/抗氧化平衡密切相關。黃芪抗氧化、抗纖維化機制的研究，為黃芪在IPF治療中的應用提