CKLF1-C19多肽對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化病變的干預(yù)作用.pdf

1、研究背景：
　　Chemokine-like factor1（CKLF1）是北京大學(xué)人類疾病基因研究中心首次在國際上克隆的一個(gè)新細(xì)胞因子，獲國內(nèi)和國際專利1。CKLF1含有CC家族趨化因子的特征性結(jié)構(gòu)，有研究表明CKLF1對(duì)白細(xì)胞趨化作用，可促進(jìn)小鼠骨骼肌的增殖，并可促進(jìn)人低密度骨髓增殖及集落形成等1。研究證實(shí) CKLF1的功能性受體是CCR42。緊隨 CKLF1的源頭創(chuàng)新工作，本課題組曾首次在國際上報(bào)道了CKLF1在哮喘患者的外

2、周血單個(gè)核細(xì)胞及氣道粘膜中高表達(dá)3；首次報(bào)道了CKLF1可在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)支氣管肺的炎性損傷及重塑作用4,5。因此干預(yù)CKLF1介導(dǎo)的炎癥趨化作用，尋找新的相關(guān)治療靶點(diǎn)無疑具有重要的臨床意義。
　　進(jìn)一步的研究表明重組CKLF1在果蠅 S2細(xì)胞中可分泌一個(gè)位于C末端的19個(gè)氨基酸肽段，被命名為CKLF1-C19多肽，簡稱C196。實(shí)驗(yàn)表明C19可抑制由CKLF1導(dǎo)致的趨化作用，在小鼠支氣管哮喘、過敏性鼻炎等疾病中發(fā)揮著干預(yù)治療作用，

3、可能是CKLF1的有效拮抗劑7,8。因此，我們推測(cè)C19亦可在肺纖維化病變中發(fā)揮干預(yù)炎癥的作用。為此我們將 C19合成肽引入到肺纖維化研究中。研究分為三個(gè)部分：第一部分探討無創(chuàng)肺功能監(jiān)測(cè)在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中的應(yīng)用價(jià)值；第二部分探討 C19在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中的干預(yù)保護(hù)作用；第三部分探討 C19在不同給藥階段對(duì)于博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中的治療作用。
　　第一部分：探討無創(chuàng)肺功能監(jiān)測(cè)在博萊霉素誘導(dǎo)的

4、小鼠肺纖維化模型中的應(yīng)用價(jià)值目的：
　　制備肺纖維化模型，探討無創(chuàng)肺功能監(jiān)測(cè)在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：
　　20只C57 BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為NS組和模型組，模型組小鼠氣管滴入0.1ml博萊霉素溶液（5mg/kg），而NS組小鼠則給0.1ml生理鹽水。在造模前、造模7、14、21天分別監(jiān)測(cè)每一只小鼠的無創(chuàng)肺功能指標(biāo)Penh值(增強(qiáng)呼吸間隙)及各自體重，并在造模21天后留取小鼠的肺組織

5、做常規(guī)H&E染色。
　　結(jié)果：
　　造模前小鼠體重及Penh值兩組均無顯著差異（P>0.05）。模型組小鼠體重在造模7、14、21天顯著低于NS組（P<0.05）；而模型組Penh值在造模7、14、21天卻顯著高于NS組（P<0.05）。在肺組織HE染色中可見模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞、炎癥細(xì)胞浸潤及局部纖維增生，且小鼠肺纖維化程度（Ashcroft評(píng)分）與Penh值呈高度正相關(guān)（r=0.869，P＜0.001）。
　　

6、結(jié)論：
　　Penh值與博萊霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化模型中的膠原纖維沉積和肺組織病理改變成高度正相關(guān)，可有效反映肺纖維化病理改變，并作為氣流受阻及肺阻力的動(dòng)態(tài)指標(biāo)。
　　第二部分：探討C19在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中的干預(yù)保護(hù)作用目的：
　　探討C19在博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中的干預(yù)保護(hù)作用。
　　方法：
　　50只C57 BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為NS組、模型組及藥物低中高劑量組。模型組和藥物低

7、中高劑量組小鼠氣管滴入0.1ml博萊霉素溶液（5mg/kg），而NS組小鼠則給0.1ml生理鹽水。在造模當(dāng)天即給予藥物組小鼠腹腔注射 C19溶液，并從造模當(dāng)天直至造模第21天，C19按藥物低中高劑量組的不同分別給予每只小鼠每天1ug、10ug、100ug；而模型組和NS組小鼠則給予同等體積的生理鹽水腹腔注射。記錄小鼠每天生存狀態(tài)及體重，在造模第21天留取小鼠肺泡灌洗液（BALF），并留取左肺的肺組織行H&E染色，觀察其病理形態(tài)改變；留取

8、小鼠右肺的肺組織行羥脯氨酸（HYP）含量測(cè)定。
　　結(jié)果：
　　在小鼠一般生存狀態(tài)觀察、體重分析中藥物低中高劑量組優(yōu)于模型組；在肺泡灌洗液中的細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺組織羥脯氨酸含量統(tǒng)計(jì)中，藥物低中高劑量組小鼠均顯著低于模型組小鼠；在病理學(xué)形態(tài)觀察中，藥物低中劑量組與模型組相比較，可顯著減輕炎癥細(xì)胞的浸潤及間質(zhì)纖維細(xì)胞的增生，較好的恢復(fù)了小鼠正常的肺組織結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：
　　C19可降低博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的死亡率、

9、減輕肺部炎癥細(xì)胞的浸潤和間質(zhì)纖維細(xì)胞的增生、及顯著降低肺組織羥脯氨酸的含量。其中 C19低劑量組與其他藥物組相比，更能顯著減輕肺部炎癥細(xì)胞的浸潤和間質(zhì)纖維細(xì)胞的增生第三部分：探討C19在不同給藥階段對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型的治療作用。
　　目的：
　　探討 C19在不同給藥階段對(duì)于博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化模型中的治療作用。
　　方法：
　　80只C57 BL/6雌性小鼠隨機(jī)分為8組：○1 NS組，每天每

10、只小鼠給予腹腔注射0.2ml生理鹽水；○2模型組，每天每只小鼠給予腹腔注射0.2ml生理鹽水；○3 C19-1ug1-21天組（每只小鼠每天腹腔注射1ug的C19溶液，從造模當(dāng)天至造模第21天）；○4 C19-1ug1-10天組（每只小鼠每天腹腔注射1ug的C19溶液，從造模當(dāng)天至造模第10天）；○5 C19-1ug7-21天組（每只小鼠每天腹腔注射1ug的C19溶液，從造模第7天至造模第21天）；○6 C19-5ug1-21天組（每只

11、小鼠每天腹腔注射5ug的C19溶液，從造模當(dāng)天至造模第21天）；○7 C19-5ug1-10天組（每只小鼠每天腹腔注射5ug的C19溶液，從造模當(dāng)天至造模第10天）；○8 C19-5ug7-21天組（每只小鼠每天腹腔注射5ug的C19溶液，從造模第7天至造模第21天）。記錄小鼠每天生存狀態(tài)，并在實(shí)驗(yàn)前，造模第3、7、11、14、17、21天分別測(cè)各組小鼠的無創(chuàng)肺功能指標(biāo)。在造模第21天深度麻醉所有小鼠后，監(jiān)測(cè)小鼠有創(chuàng)肺功能指標(biāo)，再行腹主

12、動(dòng)脈放血，用4℃PBS進(jìn)行肺泡灌洗（每次0.8ml,抽吸3次，總共灌洗3次），留取肺泡灌洗液行細(xì)胞計(jì)數(shù)。并留取小鼠左肺的肺組織行H&E染色，觀察其病理形態(tài)改變；留取小鼠右肺的肺組織行羥脯氨酸含量測(cè)定。
　　結(jié)果：
　　通過對(duì)小鼠生存率、體重、Penh值、氣道內(nèi)阻力、BALF中的細(xì)胞計(jì)數(shù)、肺組織HYP含量及病理切片H&E染色的方面分析，C19的1ug三個(gè)不同組別對(duì)于肺纖維化均有明顯的治療作用。而C19的5ug組在造模當(dāng)天開始給

13、藥的1-21天組和1-10天組在生存率、體重、肺功能、BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)、HYP含量、病理等方面有不同程度上可對(duì)肺纖維化有保護(hù)干預(yù)作用，但從造模第7天開始給藥的組別小鼠死亡率顯著高于模型組小鼠，且在HYP含量、病理方面也接近于模型組的結(jié)果，其緩解肺纖維化的效果不十分顯著。
　　結(jié)論：
　　C19（1ug）可降低博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的死亡率、減緩造模所致體重下降的趨勢(shì)、緩解造模所致的Penh值和氣道內(nèi)阻力升高的趨勢(shì)、降低肺