博萊霉素致動物肺纖維化干預(yù)方法的系列研究.pdf

1、肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一組病因各異、結(jié)局相似的疾病譜，特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是其中一種最為常見的類型，生存期平均僅2—3年，預(yù)后差。美國胸科學(xué)會（ATS）和歐洲呼吸學(xué)會（ERS）推薦的聯(lián)合治療包括皮質(zhì)激素和硫唑嘌呤或環(huán)磷酰胺，但目前臨床上缺乏足夠而可靠的證據(jù)說明其有效性，尤其是近些年將IPF定義為組織病理學(xué)上的尋常型間質(zhì)性肺炎（usual i

2、nterstitial pneumonia，UIP）后，IPF用糖皮質(zhì)激素的療效僅為0%——10%，而且由于糖皮質(zhì)激素諸多的的副作用，嚴(yán)重限制了其臨床應(yīng)用，因此尋找新型、有效、副作用小的IPF治療藥物或方法已迫在眉睫，本研究針對這一難題展開了系列研究，分別探討了三氧化二砷、胚胎干細(xì)胞（ESC）移植和自體骨髓源性細(xì)胞（BMDCs）動員對肺纖維化的影響，旨在尋找有效而實用的方法用于IPF的治療，分為如下三個部分。 第一部分 三氧化二

3、砷對博萊霉素致大鼠肺纖維化的影響 目的：觀察三氧化二砷（Arsenic Trioxide，ATO，As2O3）對博萊霉素致大鼠肺纖維化的影響以及部分機(jī)理的探討。 方法：動物分組：使用216只雄性SD大鼠作為模型動物，按照處理方式不同隨機(jī)分為四組，分別為：對照組（氣管內(nèi)滴注生理鹽水，腹腔注射生理鹽水）、模型組（氣管內(nèi)單次滴注博萊霉素5mg/kg造模，腹腔注射生理鹽水）、ATO治療組（氣管內(nèi)單次滴注博萊霉素造模，每天腹腔注射

4、ATO0．6mg/kg）和激素治療組（氣管內(nèi)單次滴注博萊霉素造模，每天腹腔注射地塞米松3mg/kg）。每組按照造模后開始干預(yù)的時間不同分為14天干預(yù)組和28天干預(yù)組兩個亞組，每個亞組再按觀察時間不同分為14天、28天和56天觀察組。觀察項目：包括肺組織羥脯氨酸含量測定以了解肺纖維化的程度、肺組織HE染色半定量分析以觀察肺泡炎和肺纖維化程度、肺組織標(biāo)本Masson染色以分析膠原含量的變化、各種細(xì)胞因子免疫組化染色和脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶

5、介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）染色，以探討藥物作用機(jī)理。 結(jié)論：三氧化二砷治療較之激素治療，可明顯提高大鼠的存活率和中位生存時間；降低肺組織的羥脯氨酸含量并減少膠原沉積。其治療機(jī)理可能與誘導(dǎo)肺內(nèi)炎性細(xì)胞凋亡增加，調(diào)節(jié)失衡的細(xì)胞因子比例等有關(guān)。是一種值得探討的IPF新的治療手段。 第二部分 胚胎干細(xì)胞對博萊霉素致小鼠肺損傷的影響 目的：比較三種不同種類的胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells ES

6、C）即C57BL/6J—ESC、S8—ESC和人—ESC對博萊霉素所致C57BL/6J小鼠肺損傷的治療作用。選擇出作用最佳的細(xì)胞，并研究多次注射該細(xì)胞對肺損傷的治療作用。 方法： 一、單次經(jīng)尾靜脈移植胚胎干細(xì)胞對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺組織損傷的治療作用觀察： 1、動物分組：C57BL/6J雌性小鼠50只，隨機(jī)分為：空白對照組、模型組、模型+C57BL/6J胚胎干細(xì)胞組、模型+S8——胚胎干細(xì)胞組、模型+人胚胎干細(xì)胞

7、組； 2、動物模型制作及胚胎干細(xì)胞移植：除空白對照組外，其余四組均經(jīng)氣管給予博萊霉素制做肺損傷模型，三組干細(xì)胞給予組小鼠在造模后一小時，分別經(jīng)尾靜脈移植1．0×106/ml的C57BL/6J胚胎干細(xì)胞，S8胚胎干細(xì)胞和人胚胎干細(xì)胞，模型組給予相同體積的生理鹽水。 3、分別觀察小鼠生存時間、肺組織病理變化、肺組織羥脯氨酸含量的測定和干細(xì)胞肺內(nèi)定植情況。 二、兩次經(jīng)尾靜脈移植胚胎干細(xì)胞對博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺損傷的治療

8、作用觀察： 1、動物分組：C57BL/6J雌性小鼠30只，隨機(jī)分為博萊霉素模型組（簡稱：模型組）、實驗1組（單次移植S8ESC）以及試驗2組（兩次移植S8ESC）； 2、動物模型制作及胚胎干細(xì)胞移植：S8ESC移植組小鼠在造模后一小時，分別經(jīng)尾靜脈移植1．0×106/ml的S8ESC，模型組給予相同體積的生理鹽水，試驗2組在造模后第三天再次注入S8ESC，模型組以及試驗1組給予相同體積的生理鹽水； 3、分別觀察小

9、鼠生存時間、肺組織病理變化和羥脯氨酸含量。 結(jié)論：S8胚胎干細(xì)胞多次移植可有效地提高C57BL/6J小鼠肺組織對博萊霉素的耐受性，減輕肺組織的急性期損傷，提示胚胎干細(xì)胞移植可能是一條早期干預(yù)肺纖維化的有效新途徑，值得進(jìn)一步探討。 第三部分 G—CSF動員自體骨髓源性細(xì)胞對博萊霉素致小鼠肺損傷的影響 目的：觀察粒細(xì)胞集落刺激因子（G—CSF）動員自體BMDCs對博萊霉素所致小鼠肺損傷的修復(fù)作用及機(jī)制探討。

10、方法一、實驗小鼠的骨髓重建方法的建立： 1、實驗小鼠致死劑量X射線全身照射清髓，然后將帶有帶有綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因C57BL/6J雄性小鼠骨髓注入清髓后的實驗小鼠體內(nèi)，使其帶上綠色熒光標(biāo)記，以便示蹤觀察供體BMDCs在受體小鼠體內(nèi)的定植和分化情況。 2、分組處理：20只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，A組為移植組（全身照射+骨髓移植）；B組為對照組（全身照射）。照射后，A組接受GFP轉(zhuǎn)基因小鼠

11、的骨髓移植，B組不予移植。 3、觀察指標(biāo)：（1）存活和體重變化情況；（2）外周血白細(xì)胞數(shù)量；（3）實驗第28天時骨髓細(xì)胞中GFP表達(dá)情況等，以確定帶有GFP標(biāo)記的骨髓重建是否成功。 二、骨髓重建小鼠G—CSF動員自體BMDCs對博萊霉素所致肺損傷作用的觀察： 1、動物分組：60只骨髓重建后的小鼠隨機(jī)分為兩組，每組各30只，A組為動員組（博萊霉素+G—CSF）；B組為對照組（博萊霉素+生理鹽水）。每組再各分為3個亞

12、組，分別在實驗第3、7和14天處死取材。 2、觀察項目：（1）肺組織病變?nèi)庋巯麓篌w觀察；（2）肺組織病理切片在光學(xué)顯微鏡下觀察；（3）Masson三聯(lián)染色觀察肺組織內(nèi)膠原沉積；（4）免疫組化方法檢測肺組織內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)，包括：轉(zhuǎn)化生長因子—β1（TGF—β1）、干擾素—γ（IFN—γ）、基質(zhì)金屬蛋白酶—9（MMP—9）和金屬蛋白酶組織抑制物—1（TIMP—1）；（5）肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量的測定；（6）肺組織內(nèi)GFP陽性細(xì)胞的表達(dá)

13、情況。 三、非骨髓重建小鼠G—CSF動員自體BMDCs對博萊霉素所致肺損傷作用的觀察： 1、動物分組：75只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為三組，C組為動員組，n=30，（博萊霉素+G—CSF）；D組為對照組，n=30，（博萊霉素+生理鹽水）；N組為正常組，n=15，（生理鹽水代替博萊霉素）。每組再各分為3個亞組，分別在實驗第3、7和14天處死取材。 2、觀察項目包括：（1）肺組織病變?nèi)庋巯麓篌w觀察；（2）肺組織病理

14、切片在光學(xué)顯微鏡下觀察；（3）Masson三聯(lián)染色觀察肺組織內(nèi)膠原沉積：（4）免疫組化方法檢測肺組織內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá)；（5）肺組織內(nèi)羥脯氨酸含量的測定；（6）肺通透指數(shù)（LPI）：支氣管肺泡灌洗液（BALF）蛋白含量/血清蛋白含量。（7）另將20只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為兩組，動員組（E組）10只，（博萊霉素+G—CSF）；對照組（F組）10只，（博萊霉素+生理鹽水）。兩組不設(shè)終點(diǎn)，觀察小鼠的存活時間。 結(jié)論： G—CSF動員