Jagged1和p53共同參與病理性心肌肥厚中心肌微血管內(nèi)皮細胞損傷的分子機制.pdf

1、眾所周知，高血壓可以引起心肌肥厚，起初的病理性心肌肥厚是心肌細胞適應(yīng)壓力負荷的一種代償機制，但長時間的肥厚刺激，加之肥厚自身的有害性最終將導(dǎo)致心室的擴大、左室功能的減退和慢性心力衰竭的發(fā)生；目前來講，慢性心力衰竭在我們當(dāng)今社會中仍然存在著較高的病死率，如何延緩心肌肥厚到心力衰竭的進展仍然是我們需要解決的話題。因此，對心肌肥厚發(fā)生發(fā)展機制的闡述具有其一定的必要性及現(xiàn)實性。以往的研究認為，在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展的過程中，存在著心肌細胞和微血管數(shù)

2、量之間的不平衡，使得心肌細胞相對缺氧，最終導(dǎo)致心肌肥厚發(fā)展到心力衰竭。盡管腎素-血管緊張素系統(tǒng)，尤其是血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展中的重要作用早已明確，伴隨著血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEⅠ)及血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑(ARBs)在臨床中的廣泛應(yīng)用，AngⅡ在心肌肥厚治療中的地位亦被大多數(shù)學(xué)者所認可，但以往基于AngⅡ?qū)π呐K影響的研究主要集中在其對心肌細胞凋亡和心肌重構(gòu)的探討上，其對心臟微血管的作用目前尚鮮有研究、作用機理亦

3、尚未明確，因此本研究主要探討AngⅡ?qū)π呐K微血管的作用及其可能的分子機制，以期對心肌肥厚發(fā)生發(fā)展機理提供新的研究思路。
　　 P53，腫瘤抑制因子，由393個氨基酸組成，是調(diào)節(jié)細胞周期、細胞衰老及凋亡的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。生理條件下，p53蛋白在心臟組織中維持在較低的水平上，但在心肌細胞缺氧的條件下，p53蛋白被上調(diào)、左心室收縮功能障礙，但其并不直接導(dǎo)致心肌細胞死亡，而是通過抑制心臟血管的新生間接導(dǎo)致了心肌細胞死亡，進而影響了左室

4、的收縮功能。當(dāng)p53發(fā)生磷酸化之后，不但失去野生型p53抑制腫瘤增殖的作用，而且突變本身又使該基因具備癌基因功能。突變的p53蛋白與野生型p53蛋白相結(jié)合所形成的寡聚蛋白不能結(jié)合DNA，使得一些癌變基因轉(zhuǎn)錄失控最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。例如，p53可以被ATM，ATR和DNA-PK等在Ser15和Ser37位磷酸化，從而抑制p53的泛素化降解，促進p53的激活和積累。Chk1和Chk2可以磷酸化p53的Ser20，促進p53的四聚化，增強其穩(wěn)

5、定性和活性。P53的Ser46磷酸化和其誘導(dǎo)細胞凋亡密切相關(guān)。P53的Ser392可以被CAK磷酸化，該位點磷酸化和p53的抑制生長功能及其與DNA結(jié)合并轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)。2007年，日本Komuro團隊發(fā)表在Nature的研究發(fā)現(xiàn)，壓力負荷下，p53累積，其下游保護性因子Hif-1a表達減少，使得心肌肥厚發(fā)展到心力衰竭，其在研究中提出此機制可能通過抑制心臟血管的新生間接導(dǎo)致心肌細胞死亡的這一假設(shè)，但尚未闡述p53對心肌微血管影響的具體機制

6、。本文就此機理進行進一步的闡述。
　　 Jagoed1，Ⅰ型膜蛋白，Noth信號通路的一個配體，通過其Delta/Serrate/Lag2與Noth受體的EGF repeat結(jié)合參與諸如細胞表型、差異、分化、遷移、凋亡和血管新生等生理過程。盡管Jagged1在胚胎期動靜脈形成中所起的作用不可替代，但其在出生后的血管形成中并非必不可少。目前Jagged1在血管新生方面的研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域的研究上，本實驗室先前的研究也主要集中在

7、Jagged1在動脈粥樣硬化中動脈內(nèi)皮、動脈平滑肌的研究上，Jagged1在成年嚙齒類動物心肌微血管內(nèi)皮中的作用本實驗室及以外尚未有此方面的報道、其作用機制尚不是很明確。
　　 鑒于此，我們假設(shè)AngⅡ作用于心肌微血管內(nèi)皮細胞(CMVEC)上的AT1R，引起細胞膜上Notch配體-Jagged1的下調(diào)，進而增加了p53在細胞漿中的蓄積，聯(lián)動保護性因子Hif-1a下調(diào)，血管新生因子VEGF分泌減少，心臟血管新生障礙。本實驗共分為三

8、個部分分別從離體和在體兩個層面上對這一設(shè)想進行闡述。
　　 第一部分 P53參與血管緊張素Ⅱ致心肌微血管內(nèi)皮細胞功能障礙的分子機制(離體實驗)
　　 目的：P53在AngⅡ致CMVEC功能障礙中的作用。
　　 方法：1.心肌植塊法培養(yǎng)成年Wistar雄性大鼠的原代CMVEC，通過免疫熒光染色法鑒定細胞表面分子(vWF、CD31)的表達確定此種方法所培養(yǎng)的細胞為CMVEC，體外遷移實驗及體外管腔樣結(jié)構(gòu)形成實驗明確C

9、MVEC的體外血管新生能力。
　　 2.10-6M AngⅡ干預(yù)第二或第三代CMVEC18hrs后，體外管腔樣結(jié)構(gòu)形成實驗觀察其體外血管新生能力，同時采用western blotting方法觀察細胞中磷酸化p53(S392)、p53、Hif-1a及Jagged1的表達變化；realtime RT-PCR方法檢測AngⅡ干預(yù)后細胞中VEGF基因的變化；ELISA方法觀察CMVEC分泌到培養(yǎng)基中VEGF蛋白的變化。
　　 3

10、.在50μM pifithrin-a(PFT-α)阻斷p53的基礎(chǔ)上，AngⅡ干預(yù)CMVEC18hrs后，觀察CMVEC中上述指標(biāo)(phospho-p53(S392)、p53、Hif-1a、Jagged1、gene/proteinof VEGF)的變化(實驗所用方法同方法2)。
　　 結(jié)果：1.心肌植塊法培養(yǎng)出的成年大鼠原代CMVEC具有很高的純度(約95％)，此方法培養(yǎng)的CMVEC具備諸如體外遷移、體外血管新生的能力。

11、　　 2.10-6M AngⅡ干預(yù)CMVEC后，上調(diào)了細胞核中p53的磷酸化，并使得胞漿中p53的蓄積增加，同時下調(diào)了細胞核中的Hif-1a蛋白，上調(diào)了細胞膜上Jagged1的表達、胞漿內(nèi)VEGF在RNA水平的表達，但減少了分泌到培養(yǎng)基中的VEGF蛋白。
　　 3.50μM的PFT-a可以很好的阻斷p53的表達，在PFT-a阻斷p53的基礎(chǔ)上，AngⅡ干預(yù)CMVEC后，與單純AngⅡ干預(yù)組比較，CMVEC體外管腔樣結(jié)構(gòu)形成能力

12、增強，胞核中Hif-1a表達上調(diào)，分泌到培養(yǎng)基中的VEGF增加，胞膜上的Jagged1表達減少。
　　 結(jié)論：10-6M AngⅡ干預(yù)CMVEC，引起CMVEC體外管腔樣結(jié)構(gòu)形成障礙，這種損傷作用通過磷酸化細胞核中的p53，實現(xiàn)p53在胞漿中的蓄積，進而引起胞核中具有保護作用的Hif-1a下調(diào)，血管新生因子VEGF分泌減少，從而損傷了CMVEC的體外血管新生能力。上調(diào)的Jagged1配體可能作為一種代償機制參與了AngⅡ致CMV

13、EC的血管新生損傷作用。
　　 第二部分在體實驗驗證p53參與血管緊張素Ⅱ致心肌微血管內(nèi)皮細胞功能損傷的分子機制
　　 目的：對p53在AngⅡ致CMVEC功能障礙中的分子機理進行在體驗證。
　　 方法：采用皮下埋藏微量泵的方法持續(xù)給予6-8周齡C57/BL6雄性小鼠200ng/kg/minAngⅡ，給藥時間為2周(預(yù)實驗建立給藥時間為1周、2周及4周的實驗動物模型)；在建立AngⅡ干預(yù)引起心肌肥厚模型的同時，設(shè)

14、置p53抑制組，即在AngⅡ干預(yù)前一天腹腔注射3.0mg/kg PFT-a-次，隨后每間隔三天同劑量腹腔給藥一次，直至AngⅡ微量泵埋藏的第14天PFT-a給藥結(jié)束。AngⅡ給藥結(jié)束取材前，小動物心臟超聲測量小鼠左心室的肥厚程度，并用尾動脈壓測量裝置無創(chuàng)測量小鼠尾動脈壓力；取材時，稱量小鼠體重及其心臟重量，并在心臟的中1/2處將心臟橫斷為兩部分，將心尖所在部分立即投入液氮中備用于分子生物學(xué)實驗(western blotting，real

15、time RT-PCR)，心底部放入10％中性福爾馬林溶液中，用做隨后的蘇木精-伊紅染色(HE)、免疫組織化學(xué)染色(CD31)。
　　 結(jié)果：1.200ng/kg/min AngⅡ持續(xù)皮下給藥1周、2周、4周引起C57/BL6雄性小鼠心室壁的肥厚，以2周肥厚最為顯著；200ng/kg/min AngⅡ干預(yù)C57/BL6雄性小鼠2周后，CD31免疫組織化學(xué)染色顯示心臟微血管數(shù)量減少，同時有胞核中p53的磷酸化增加，胞漿中p53的蓄

16、積增多，Hif-1a在胞核中的表達下調(diào)，Jagged1在胞膜上的表達上調(diào)，VEGF在組織中的表達增加。
　　 2.3.0mg/kg PFT-a腹腔給藥，初次給藥時間為AngⅡ給藥前一天，后續(xù)每間隔三天給藥一次的方法能夠抑制p53的表達，并緩解AngⅡ給藥14天所致小鼠左心室的肥厚程度，與單純AngⅡ給藥14天組比較，此種處理增加了Hif-1a在心肌組織細胞核中的表達、減少了VEGF及Jagged1在心肌組織中的表達。
　　

17、 結(jié)論：200ng/kg/min AngⅡ干預(yù)C57/BL6雄性小鼠2周后，引起小鼠左心室肥厚，心臟微血管數(shù)量減少，且p53參與了此種損傷作用；抑制p53后，緩解了AngⅡ所致心肌的肥厚程度及心臟微血管數(shù)量的減少程度，與離體實驗p53參與了AngⅡ致CMVEC體外血管新生障礙這一實驗結(jié)果相符；但體實驗中，組織中增加的VEGF蛋白，可能是心肌細胞通過旁分泌對微血管障礙的一種代償機制。
　　 第三部分 Jagged1與p53在參與

18、血管緊張素Ⅱ致心肌微血管內(nèi)皮細胞功能障礙機理中的關(guān)系
　　 目的：分析Jagged1在AngⅡ所致CMVEC功能障礙中的角色及其與p53的關(guān)系。
　　 方法：心肌植塊法培養(yǎng)成年Wistar雄性大鼠的原代CMVEC，anti-rat Jagged1 siRNA預(yù)處置第二或第三代CMVEC后，10-6M AngⅡ干預(yù)CMVEC18hrs，體外管腔樣結(jié)構(gòu)形成實驗觀察CMVEC的體外血管新生能力，western blotting

19、方法觀察CMVEC中磷酸化p53(S392)、p53、Hif-1a的表達變化，realtime RT-PCR方法檢測AngⅡ干預(yù)后CMVEC中VEGF基因的變化；ELISA方法觀察培養(yǎng)基中分泌性蛋白-VEGF的變化。
　　 結(jié)果：與單純AngⅡ干預(yù)組相比，anti-rat Jagged1 siRNA預(yù)處置后、AngⅡ干預(yù)，CMVEC體外管腔樣結(jié)構(gòu)形成能力增強，胞核中p53的磷酸化減少，但p53在胞漿中的累積、Hif-1a在胞核及