高效研究多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合特性新策略的建立及其應(yīng)用.pdf

1、結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)相互作用研究的一個(gè)簡(jiǎn)單高效的入手點(diǎn)在蛋白質(zhì)組學(xué)規(guī)模上研究蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)是全面了解蛋白質(zhì)功能、揭示疾病發(fā)病機(jī)制的有效手段之一。節(jié)點(diǎn)蛋白在相互作用網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)關(guān)鍵位置，在生命調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要功能，可作為研究相互作用網(wǎng)絡(luò)的一個(gè)有效突破點(diǎn)。很多蛋白由單個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域組成；絕大多數(shù)蛋白質(zhì)相互作用是通過(guò)相互作用結(jié)構(gòu)域(如PDZ，SH2，WW，SH3等)與其識(shí)別模體的結(jié)合完成的。深入研究節(jié)點(diǎn)蛋白的相互作用結(jié)構(gòu)域，不僅可以了解詳細(xì)的相

2、互作用分子機(jī)制，為蛋白質(zhì)相互作用的藥物研發(fā)提供理論基礎(chǔ)，而且可以在全蛋白質(zhì)組水平上發(fā)現(xiàn)其所有的潛在配體蛋白，繪制以節(jié)點(diǎn)蛋白的相互作用為骨架的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，從而系統(tǒng)地揭示蛋白質(zhì)在復(fù)雜體系中的多樣功能。 本研究中，我們以最重要的蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域之一的PDZ結(jié)構(gòu)域作為入手點(diǎn)，建立了高效研究結(jié)構(gòu)域結(jié)合特性的新策略，全面系統(tǒng)地研究了數(shù)個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性，發(fā)現(xiàn)了它們潛在的新配體蛋白。研究結(jié)果表明，PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性同時(shí)

3、具有較強(qiáng)的規(guī)律性和一定的多樣性。由于我們研究的PDZ在多種組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)中均有各種功能的潛在新配體被發(fā)現(xiàn)，提示PDZ蛋白在不同的體系中執(zhí)行不同的功能具有生物化學(xué)基礎(chǔ)，可能是一個(gè)相當(dāng)普遍的現(xiàn)象。PDZ蛋白潛在的多功能性超過(guò)了我們的預(yù)期。我們猜想可能許多具有常見(jiàn)蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域的蛋白也會(huì)具有超過(guò)我們以往估計(jì)的配體數(shù)量和功能多樣性。這個(gè)猜想需要更多結(jié)構(gòu)域的系統(tǒng)研究方法和大規(guī)模研究才能證實(shí)。 高效研究多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域(peptide-

4、binding domain)結(jié)合特性新策略的提出近年來(lái)常用的高通量研究結(jié)構(gòu)域的方法主要有定向肽庫(kù)(oriented peptidelibrary)、SPOT合成、噬菌體展示(phage display)和酵母雙雜交(yeast two-hybrid)等。但是這些傳統(tǒng)方法都是針對(duì)某一個(gè)特定結(jié)構(gòu)域所進(jìn)行的大規(guī)模篩選，相對(duì)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。為了適應(yīng)于在蛋白質(zhì)組學(xué)規(guī)模上研究結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性、提高研究通量和效率，我們提出了一種高效地驗(yàn)證性篩選目的結(jié)構(gòu)域

5、結(jié)合配體文庫(kù)的新研究策略。先用目的結(jié)構(gòu)域家族中有代表性的成員篩選隨機(jī)多肽文庫(kù)，收集得到的陽(yáng)性克隆構(gòu)建成一個(gè)配體庫(kù)，其它成員直接驗(yàn)證篩選配體庫(kù)研究其識(shí)別特性。根掘驗(yàn)證篩選得到的陽(yáng)性和陰性結(jié)合序列推知識(shí)別規(guī)律，再以此識(shí)別規(guī)律在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)潛在的天然配體，最后在酵母雙雜交系統(tǒng)中驗(yàn)證并發(fā)現(xiàn)新的配體蛋白。如果直接驗(yàn)證篩選配體庫(kù)得到的陽(yáng)性配體數(shù)量不足以得出某個(gè)結(jié)構(gòu)域的識(shí)別特性，該結(jié)構(gòu)域就從頭篩選隨機(jī)多肽文庫(kù)，所獲得的新陽(yáng)性克隆添加到配體庫(kù)，作

6、為對(duì)配體庫(kù)的補(bǔ)充，可提高以后通過(guò)直接驗(yàn)證篩選來(lái)研究此類(lèi)PDZ的效率。另外在驗(yàn)證預(yù)測(cè)的天然配體時(shí)，構(gòu)建的克隆也添加到配體庫(kù)中，這也是對(duì)配體庫(kù)的重要補(bǔ)充，這樣直接驗(yàn)證篩選就有可能找到新的配體蛋白。驗(yàn)證篩選體系最大的優(yōu)點(diǎn)是，與傳統(tǒng)篩選相比研究效率得到了極大的提高，而且整個(gè)體系是動(dòng)態(tài)發(fā)展的，配體庫(kù)會(huì)在體系的應(yīng)用過(guò)程中不斷得到補(bǔ)充，擴(kuò)充后的配體庫(kù)又會(huì)進(jìn)一步提高研究效率。高效研究多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合特性新策略的建立我們首先將驗(yàn)證篩選的研究策略應(yīng)用于P

7、DZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合特性的研究。 首先，我們收集ZO-1 PDZ1、ZO-1 PDZ3和Erbin PDZ篩選隨機(jī)多肽文庫(kù)得到的陽(yáng)性克隆，構(gòu)建成一個(gè)初始的配體庫(kù)。通過(guò)驗(yàn)證篩選該配體庫(kù)快速研究了HtrA2 PDZ和LNX1 PDZ2的識(shí)別特性。MAGI3 PDZ4等PDZ通過(guò)驗(yàn)證篩選沒(méi)有得到滿意的結(jié)果，因此從頭篩選隨機(jī)多肽文庫(kù)研究其結(jié)合特性，并將得到的陽(yáng)性克隆補(bǔ)充到配體庫(kù)中，作為對(duì)配體庫(kù)的補(bǔ)充和發(fā)展。 在驗(yàn)證篩選體系建立和初步發(fā)

8、展的過(guò)程中，我們對(duì)上述目的PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性進(jìn)行了詳細(xì)的分析。研究結(jié)果不僅涵蓋了以往大規(guī)模研究方法報(bào)道的結(jié)果，而且還發(fā)現(xiàn)了新的PDZ結(jié)構(gòu)域識(shí)別特性，即：ZO-1 PDZ3在配體．5位偏好疏水性氨基酸，ZO-1PDZ3、LNX1 PDZ2和MAG13 PDZ4在配體的0位可選擇極性氨基酸，除MAGI3 PDZ4外的五個(gè)PDZ在配體-1位都強(qiáng)烈偏好芳香族氨基酸，除ZO-1 PDZ3和：MAGI3 PDZ4外的四個(gè)PDZ都可識(shí)別Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

9、三種類(lèi)型的PDZ配體，HtrA2 PDZ和LNX1 PDZ2的選擇特異性都呈現(xiàn)出一定的前后氨基酸之間的連鎖關(guān)系。這些新的PDZ結(jié)合特性的揭示，為PDZ結(jié)構(gòu)域的重新定義和分類(lèi)提供了有價(jià)值的信息。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)了以此六個(gè)目的PDZ結(jié)構(gòu)域?yàn)楣?jié)點(diǎn)的40對(duì)新的蛋白質(zhì)相互作用，為深入研究這些PDZ蛋白的生物學(xué)功能提供了重要線索。 ●高效研究多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合特性新策略的應(yīng)用 LNX蛋白是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的含有PDZ結(jié)構(gòu)域的RING類(lèi)型的

10、泛素連接酶E3，但是其PDZ結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能還不清楚。為了揭示LNX PDZ結(jié)構(gòu)域的功能，我們應(yīng)用已建立的高效驗(yàn)證篩選體系對(duì)人類(lèi)LNX家族的4個(gè)蛋白含有的9個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性和相互作用蛋白進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。 LNX1 PDZ1、LNX1 PDZ2、LNX1 PDZ3、LNX2 PDZ2和LNX4 PDZ通過(guò)驗(yàn)證篩選和/或隨機(jī)多肽文庫(kù)篩選得到的陽(yáng)性配體在C末端呈現(xiàn)明顯的規(guī)律，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)這5個(gè)PDZ結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特性有共性但也

11、有顯著的不同。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)了LNX家族PDZ結(jié)構(gòu)域之間的三對(duì)相互作用，即：LNX1 PDZ1和LNX1 PDZ4、LNXl PDZ1和LNX2 PDZ4、LNX2 PDZ1和LNX2 PDZ4之間的相互作用。另外，根據(jù)總結(jié)的LNXPDZ結(jié)構(gòu)域的識(shí)別規(guī)律，我們?cè)谌祟?lèi)蛋白質(zhì)組水平上發(fā)現(xiàn)了新的LNX配體蛋白。這些配體蛋白種類(lèi)多樣且分布廣泛，提示LNX可能在多種復(fù)雜體系中發(fā)揮多樣的功能。 同時(shí)，在PDZ結(jié)構(gòu)域高效驗(yàn)證篩選體系應(yīng)用的過(guò)程

12、中，我們對(duì)原PDZ配體庫(kù)又補(bǔ)充了新的配體，這是對(duì)配體庫(kù)的再次發(fā)展，將會(huì)使驗(yàn)證篩選體系的高效性在更大規(guī)模的PDZ結(jié)構(gòu)域研究中得以體現(xiàn)。 ● Liddle綜合癥分子治療的初步探索 Liddle綜合癥是一種上皮細(xì)胞鈉離子通道相關(guān)的遺傳性疾病，是1963年由Liddle等人首先發(fā)現(xiàn)的一種常染色體顯性、鹽敏感型的高血壓綜合癥。Liddle綜合癥的分子發(fā)病機(jī)制現(xiàn)已較為明確地認(rèn)為是上皮鈉離子通道(epithelial Na<'+>ch

13、annel，ENaC)的β亞基或γ亞基的胞質(zhì)側(cè)羧基端的PY模體低頻率的點(diǎn)突變或缺失突變，使其與泛素連接酶Nedd4的WW結(jié)構(gòu)域之間的相互作用被打斷，導(dǎo)致ENaC不能正常泛素化和降解，因而在質(zhì)膜上的半壽期延長(zhǎng)、活性增加，導(dǎo)致鈉離子重吸收的增加，引起Liddle綜合癥。 由于Liddle綜合癥的發(fā)病機(jī)制已經(jīng)研究的比較清楚，而且僅是單基因的突變所致，這為分子治療提供了可能。我們提出了一種從分子水平上治療Liddle綜合癥的設(shè)想，即構(gòu)建

14、一種可識(shí)別Liddle病人中ENaC蛋白突變的PY模體的人工泛素連接酶E3，使其結(jié)合并降解突變的ENaC蛋白，從而使質(zhì)膜上ENaC的表達(dá)數(shù)量和活性恢復(fù)到正常水平。而可識(shí)別PY突變體的E3，可通過(guò)用病人中的PY突變體篩選隨機(jī)多肽庫(kù)獲得與之結(jié)合的隨機(jī)肽段，然后用其替換PY模體天然配體蛋白Nedd4中的WW結(jié)構(gòu)域，從而得到一個(gè)新的人工E3。本論文中，我們以一種Liddle綜合癥突變體Y620H為誘餌蛋白，通過(guò)篩選隨機(jī)多肽文庫(kù)獲得了一個(gè)至少能與