慢性HBV感染患者甲基CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族的研究.pdf

1、第一部分慢性乙型肝炎患者甲基CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族成員的研究
　　研究背景:
　　乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈全球性流行。目前，全球慢性HBV感染患者大約有2.4億，其中每年因此病致死的人數(shù)多達(dá)65萬。慢性HBV感染是由HBV復(fù)制與宿主免疫應(yīng)答協(xié)同作用而構(gòu)建的動態(tài)過程。研究表明，表觀遺傳學(xué)調(diào)控尤其是DNA甲基化參與慢性HBV感染的過程，并在慢性HBV感染患者的結(jié)局中發(fā)揮重要作用。
　　甲基

2、CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(methyl-CpG binding domain，MBD)家族蛋白作為表觀遺傳學(xué)中DNA甲基化的“讀出器”，能夠識別基因組中CpG島上甲基化的胞嘧啶殘基，募集協(xié)同抑制因子，從而調(diào)控基因表達(dá)。此外，MBD蛋白的轉(zhuǎn)錄抑制作用也體現(xiàn)在染色質(zhì)重構(gòu)與組蛋白修飾的相互串?dāng)_中。MBD家族主要成員獨(dú)特的表觀遺傳學(xué)修飾功能，使得它們在腫瘤發(fā)生中可能的作用與機(jī)制也被學(xué)者所揭示。而最近的研究同時觀察到了MBD家族主要成員在自身免疫性疾病，

3、如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）等疾病中的變化。然而，慢性HBV感染過程中，MBD家族成員是否存在變化，能否在疾病進(jìn)展中發(fā)揮表觀遺傳學(xué)調(diào)控作用，卻仍未被闡明。
　　目的:
　　本研究旨在測定慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者M(jìn)BD家族主要成員的變化，評估其在CHB病情進(jìn)展中可能

4、的作用與聯(lián)系。
　　研究方法:
　　本研究納入369例CHB患者與14例正常對照(healthy controls，HCs)人群。369例CHB患者是2014年6月-2016年8月于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝病科收集的。研究組中223例CHB患者是2014年6月-2015年10月收集的，由20例免疫耐受(immune tolerant，IT)期、69例免疫清除(immune clearance，IC)期、103例低（非）復(fù)制期(no

5、n/low-replicative，LR)期與31例再活動(HBeAg negative hepatitis，ENH)期患者所構(gòu)成。驗(yàn)證組中146例CHB患者是2015年11月-2016年8月收集的，由16例IT期、44例IC期、67例LR期與19例ENH期患者所構(gòu)成。所有CHB患者中共有40例接受肝穿刺組織病理學(xué)檢查，其中研究組有34例，而驗(yàn)證組僅6例。谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)與血小板

6、(platelet，PLT)比率指數(shù)(AST-to-PLT ratio index，APRI)積分被用于CHB患者肝臟纖維化程度的評估。CHB與HCs外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中MBD家族主要成員mRNA的表達(dá)情況通過實(shí)時熒光定量PCR(quantitativereal-time polymerase chain reaction, RT-PCR)法測定。

7、　　結(jié)果:
　　1.CHB患者PBMCs中MeCP2、MBD1、MBD2以及MBD4 mRNA水平均高于HCs。但是，CHB患者與HCs的MBD3 mRNA水平無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.CHB患者中MBD家族主要成員mRNA與病情嚴(yán)重程度的聯(lián)系:CHB患者M(jìn)BD2 mRNA水平與血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）水平間呈正相關(guān)(r=0.151，P=0.028)，MBD4 mRNA水平與血

8、清ALT（r=0.18，P=0.008）、AST水平(r=0.208，P=0.003)間分別呈正相關(guān)。然而，MBD家族其他成員與肝功能指標(biāo)間并無統(tǒng)計學(xué)聯(lián)系。
　　3.研究組中，HBeAg陽性患者HBV DNA均為陽性，且此類患者的MBD2與MBD4 mRNA相較陰性患者高表達(dá)。而HBeAg陰性患者則是由HBV DNA陽性患者（組a）與陰性患者（組b）組成。我們觀察到組a患者PBMCs中MBD2、MBD3、MBD4 mRNA相較組b

9、卻為低表達(dá)。
　　4.CHB患者不同免疫分期間比較:CHB患者4個免疫分期PBMCs中MeCP2、MBD1與MBD2 mRNA水平均高于HCs。其中，MBD1 mRNA水平為IT期顯著高于其他3期;MBD2與MBD4 mRNA水平則為IC期顯著高于其他3期。MBD3mRNA水平卻是僅IC期高于HCs。MBD4 mRNA水平是除ENH期外，IT、IC與LR期均高于HCs，同時LR期高于ENH期。但是，MeCP2與MBD3 mRNA水

10、平在4個免疫分期間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　5.MBD1 mRNA對IT期的預(yù)測價值:雙變量logistic回歸表明研究組中MBD1mRNA與IT期密切相關(guān)。受試者工作特征(receiver operating characteristics，ROC)曲線顯示，MBD1 mRNA預(yù)測IT期的曲線下面積(area under the curve of ROC,AUC)為0.732(P＜0.001)，最佳截斷值為0.0305，靈敏度75

11、％，特異性65.52％。驗(yàn)證組中則發(fā)現(xiàn)，MBD1 mRNA預(yù)測IT期的AUC為0.704（P=0.001），最佳截斷值是0.0305，靈敏度與特異性分別是81.25％與61.54％。
　　6.MBD2與MBD4 mRNA對IC期的預(yù)測價值:MBD2與MBD4 mRNA均與IC期密切相關(guān)。研究組中，二者預(yù)測IC期的AUC分別是0.671（P＜0.001）和0.716(P＜0.001)，但AUC間統(tǒng)計無意義。MBD2 mRNA的最佳截

12、斷值為0.0069，而MBD4 mRNA的最佳截斷值為0.00099。它們的靈敏度、特異性分別是85.51％、44.81％與63.77％、75.97％。雙變量logistic回歸擬合MBD2與MBD4 mRNA聯(lián)合變量公式是:參數(shù)（MBD2聯(lián)合MBD4）=50.591×MBD2+555.483×MBD4-2.314。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合變量預(yù)測IC期的AUC是0.736(P＜0.001)，最佳截斷值是-0.841，靈敏度68.12％

13、，特異性69.48％。而且聯(lián)合變量對IC期的預(yù)測價值明顯優(yōu)于MBD2 mRNA(P=0.0225)。驗(yàn)證組中，MBD2與MBD4 mRNA預(yù)測IC期的AUC分別為0.665(P＜0.001)和0.741（P＜0.001）。對應(yīng)的最佳截斷值、靈敏度、特異性分別是0.0069與0.00099、86.36％與70.45％、42.16％與71.57％。而聯(lián)合變量的AUC則是0.754，顯著高于MBD2 mRNA(P=0.004)。其最佳截斷值是

14、-0.841，靈敏度與特異度是70.45％與70.59％。
　　7.CHB患者不同肝臟纖維化與炎癥分期下MBD家族主要成員mRNA表達(dá)的變化:研究組中，S3+S4期患者M(jìn)eCP2 mRNA水平均高于S0-S2期患者。此外，不同肝臟炎癥分級下MBD家族主要成員中僅MBD2 mRNA水平在G2期是顯著低于G1和G3+G4期。但其他MBD家族成員mRNA在不同肝臟纖維化分級與炎癥分期下表達(dá)并無不同。
　　8.MeCP2 mRNA表

15、達(dá)對CHB患者肝臟纖維化不同程度的預(yù)測意義:MeCP2mRNA表達(dá)與肝臟纖維化程度間有著統(tǒng)計學(xué)相關(guān)。當(dāng)S≥2歸為重度纖維化時，MeCP2 mRNA與APRI積分均可預(yù)測S≥2纖維化（AUC0.761 VS0.716，P=0.707）。而將S3+S4歸為重度纖維化時，MeCP2 mRNA對其的預(yù)測價值優(yōu)于APRI積分（AUC0.958 VS0.717，P=0.0342），MeCP2 mRNA最佳截斷值是0.0068，靈敏度100％，特異性

16、85.19％。同時，MeCP2 mRNA對S4期纖維化的預(yù)測價值也優(yōu)于APRI積分(AUC0.946 VS0.677，P=0.0424)，其最佳截斷值是0.0084，靈敏度與特異性則是100％與90.32％。這說明，MeCP2 mRNA可以很好的預(yù)測反映S3+S4以及S4期纖維化。
　　9.CHB患者M(jìn)BD家族成員mRNA的相關(guān)性分析:Spearman相關(guān)分析說明，CHB患者PBMCs中MeCP2與MBD2（r=0.243，P＜0

17、.001）、MBD1與MBD3(r=0.132， P=0.049)、MBD2與MBD3(r=0.209，P=0.002)的mRNA間都有正相關(guān)聯(lián)系。提示，CHB患者M(jìn)BD家族主要成員間存在密切聯(lián)系。
　　結(jié)論:
　　1.CHB患者PBMCs中MBD家族主要成員mRNA表達(dá)異常。
　　2.PBMCs中MBD1 mRNA的表達(dá)對CHB中IT期患者有著很好的預(yù)測價值。
　　3.PBMCs中MBD2與MBD4 mRNA對

18、CHB中IC期患者有著很好的預(yù)測價值，而且MBD2與MBD4 mRNA的聯(lián)合變量對IC期的預(yù)測價值明顯優(yōu)于MBD2mRNA。
　　4.PBMCs中MeCP2 mRNA的表達(dá)可以反映CHB患者肝臟纖維化的程度。
　　5.MBD家族主要成員參與CHB的發(fā)病過程并與疾病進(jìn)展間關(guān)系密切，提示其在評估CHB病情嚴(yán)重程度中的具有較好預(yù)測價值。
　　第二部分慢加急性乙型肝炎肝衰竭患者甲基CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族成員的研究
　　研究

19、背景:
　　慢性乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染包括慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)、隱匿性CHB、乙型肝炎肝硬化、慢加急性乙型肝炎肝衰竭(acute-on-chronic hepatitis B liver failure，ACHBLF)等等。所有慢性HBV感染中病情最為兇險、短期死亡率最高的當(dāng)屬ACHBLF。該病在短期內(nèi)出現(xiàn)的肝功能惡化衰竭基于患者原有慢

20、性肝病之上。而在我國，約有八成慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)患者存在基礎(chǔ)的慢性HBV感染，他們即為ACBHLF患者。ACHBLF病情進(jìn)展迅速、短期死亡率高達(dá)85％。時至今日，ACHBLF的治療依舊面臨巨大挑戰(zhàn)。嚴(yán)重肝臟疾病患者在病情發(fā)展過程中可能會進(jìn)入肝衰竭(liver failure，LF)，即為LF傾向患者。同時，部分ACHBLF患者病情進(jìn)展迅速，但是在疾病初始階段表現(xiàn)并不明

21、顯。密切監(jiān)測與早期干預(yù)這些可能會進(jìn)展為ACHBLF或者難治性ACHBLF的患者可能會降低其發(fā)病率與死亡率。所以，早期準(zhǔn)確預(yù)測ACHBLF極其重要而且尤為迫切。
　　越來越多的學(xué)者觀察到，表觀遺傳學(xué)修飾介入到了ACHBLF患者的發(fā)病之中。先前學(xué)者已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了MBD家族成員在腫瘤發(fā)生、自身免疫性疾病中的功能。我們之前也報道了MBD家族主要成員在CHB患者外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cel

22、ls，PBMCs)中表達(dá)的改變，而且其改變提示MBD家族主要成員在評估CHB病情嚴(yán)重程度中具有較好的預(yù)測價值。ACHBLF與CHB之間存在顯著不同，它是從慢性感染向爆發(fā)性狀態(tài)轉(zhuǎn)變的。所以，研究MBD家族在ACHBLF中的作用依舊有重要意義。
　　目的:
　　本研究旨在測定ACHBLF患者M(jìn)BD家族主要成員的變化，探討MBD家族主要成員在疾病進(jìn)展中的作用，評估其對ACHBLF患者病情預(yù)后中可能的預(yù)測價值。
　　研究方法:

23、
　　本研究納入于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院肝病科收治的142例ACHBLF患者與80例CHB患者。ACHBLF患者被分為研究組與驗(yàn)證組，包含研究組92例，是2012年4月-2015年2月收治的患者;驗(yàn)證組50例，是2015年3月-2016年5月收治的患者。終末期肝病模型(model for end-stage liver disease，MELD)積分用于ACHBLF患者的病情評估。30例健康志愿者從山東大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院募集，歸為正常對照組

24、(healthy controls，HCs)。所有研究對象PBMCs中MBD家族主要成員mRNA的表達(dá)情況通過實(shí)時熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chainreaction，RT-PCR)法測定。
　　結(jié)果:
　　1.ACHBLF患者血清白蛋白(albumin，ALB)和凝血酶原活動度(prothrombinactivity，PTA)低于CHB和HCs。相反，血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶

25、(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL、國際標(biāo)準(zhǔn)化比值(international normalized ratio，INR)則高于CHB和HCs。在研究與驗(yàn)證組中，死亡組人群均具有較低的PTA和ALB，較高INR、TBIL和MELD積分以及肝性腦病(hepatic encephalopa

26、thy，HE)、腹水、自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis，SBP)的發(fā)生率。
　　2.MBD家族主要成員mRNA水平的變化: Kruskal-Wallis檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ACHBLF患者M(jìn)BD1和MBD2 mRNA表達(dá)均較CHB和HCs上調(diào)。相反，ACHBLF患者M(jìn)BD4mRNA表達(dá)卻明顯低于CHB患者，但高于HCs。此外，ACHBLF患者M(jìn)eCP2mRNA表達(dá)亦高于HCs。與HCs相比

27、，CHB患者M(jìn)eCP2、MBD1、MBD2和MBD4mRNA表達(dá)均增多。此外，死亡組患者較存活組患者M(jìn)BD1和MBD2 mRNA水平明顯升高，而MBD4 mRNA水平則顯著減低。但兩組人群在MeCP2和MBD3的mRNA表達(dá)上并無不同。
　　3.ACHBLF患者M(jìn)BD家族主要成員mRNA水平與臨床指標(biāo)的聯(lián)系:研究組中，MBD4 mRNA水平與PTA間存在正相關(guān)聯(lián)系，而與TBIL、INR和MELD積分間則存在負(fù)相關(guān)聯(lián)系。但其他MBD

28、家族成員mRNA水平與臨床指標(biāo)間并無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)。Spearman相關(guān)分析MBD家族成員間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)ACHBLF患者M(jìn)eCP2與MBD2(r=0.292,P=0.005),MBD1與MBD3(r=0.481,P＜0.001) mRNA間都有正相關(guān)聯(lián)系。
　　4.MBD4 mRNA是ACHBLF患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素:Cox比例風(fēng)險回歸模型表明MELD積分、HE和MBD4 mRNA都是ACHBLF患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素。
　

29、　5.研究組中，MBD4 mRNA表達(dá)對ACHBLF患者死亡率的預(yù)測價值:MBD4mRNA預(yù)測 ACHBLF患者1月死亡率的曲線下面積(area under the curve ofreceiver operating characteristics，AUC)為0.907，顯著高于MELD積分(0.714，P=0.0291)。說明MBD4 mRNA是一個比MELD積分更好的預(yù)測1月死亡率的指標(biāo)。MBD4 mRNA和MELD積分的最佳臨界

30、值分別為0.0005365和21.87，靈敏度與特異性分別為83.33％、92.86％與72.22％、76.69％。研究組按照最佳截斷值分組以比較組間的生存率。Log-rank分析發(fā)現(xiàn)，MBD4 mRNA≤0.0005365、MELD積分≥21.87的患者生存率較低，存活時間較短。MBD4 mRNA與MELD積分預(yù)測ACHBLF患者2月死亡率的AUC分別為0.816和0.811，最佳截斷值為0.0005469和21.87，敏感度68.0

31、9％、93.33％，特異性68.09％、84.44％。Log-rank分析發(fā)現(xiàn)MBD4mRNA≤0.0005469、MELD積分≥21.87的患者生存率較低，存活時間均較短。MBD4 mRNA與MELD積分預(yù)測ACHBLF患者3月死亡率的的AUC分別為0.762和0.847，最佳截斷值為0.0005469和21.55，敏感度62.75％、92.68％，特異性72.55％、87.8％。MBD4mRNA≤0.0005469、MELD積分≥2

32、1.55的患者生存率較低，存活時間較短。然而，它們在對患者2月與3月死亡率的預(yù)測判斷上沒有差異存在。
　　6.MBD4 mRNA表達(dá)對ACHBLF患者死亡率預(yù)測價值的驗(yàn)證:驗(yàn)證組PBMCs中MBD4 mRNA表達(dá)對ACHBLF患者1月死亡率的預(yù)測價值明顯優(yōu)于MELD積分（0.939 VS0.762，P=0.035）。MBD4 mRNA≤0.0005365、MELD積分≥21.87的患者具有較低的生存率與較短的存活時間。在預(yù)測ACB

33、HLF患者2月死亡率、3月死亡率上，兩指標(biāo)間無統(tǒng)計學(xué)差異(0.843 VS0.834，P=0.998)(0.787VS0.836，P=0.5037)。在對患者2月死亡率的預(yù)測中，MBD4 mRNA≤0.0005469、MELD積分≥21.87的患者具有較低的生存率與較短的存活時間。而在3月死亡率的預(yù)測中，MBD4 mRNA≤0.0005469、MELD積分≥21.55的患者具有較低的生存率以及較短的存活時間。
　　結(jié)論