家蠶含保幼激素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域的BmJHBP基因家族鑒定及BmJHBPd2的功能研究.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）是由古代野桑蠶經(jīng)長期馴化而成的泌絲昆蟲，在生物學(xué)領(lǐng)域是經(jīng)典的模式生物，在經(jīng)濟(jì)上具有極高的價(jià)值。由咽側(cè)體合成的保幼激素（Juvenile hormone，JH）與前胸腺合成的蛻皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）是調(diào)控家蠶生長發(fā)育以及變態(tài)的兩種重要激素。其中，JH經(jīng)過咽側(cè)體合成并分泌至血淋巴中，與保幼激素結(jié)合蛋白（Juvenile hormone binding protein，JHBP）結(jié)

2、合并被運(yùn)送到不同的靶器官，進(jìn)而調(diào)控家蠶的生長發(fā)育。家蠶的經(jīng)濟(jì)效益與合成蠶絲蛋白的發(fā)達(dá)絲腺密不可分。早有研究報(bào)道，對家蠶添食JH能夠增加絲蛋白的產(chǎn)量，而家蠶JHBP（BmJHBP）作為JH信號(hào)通路傳導(dǎo)的第一個(gè)關(guān)鍵分子，與絲蛋白合成的關(guān)系是不清楚的。此前，學(xué)者已經(jīng)鑒定了家蠶部分的BmJHBP基因，發(fā)現(xiàn)在家蠶的多個(gè)組織器官內(nèi)均有表達(dá)，其主要表達(dá)在脂肪體和中腸。本研究旨在運(yùn)用生物信息學(xué)全面鑒定并分析家蠶JHBP基因家族成員，采用RT-PCR、克

3、隆、Western blot、免疫熒光等技術(shù)手段對家蠶后部絲腺特異高量表達(dá)的BmJHBP基因的表達(dá)模式以及功能進(jìn)行了分析和研究。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴基于家蠶基因組數(shù)據(jù)庫和NCBI，首先利用生物信息學(xué)對家蠶BmJHBP基因家族成員進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，總共鑒定到了41個(gè)BmJHBP基因，分別分布在8條染色體上，主要位于第15和23號(hào)染色體。基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，家族JHBP基因結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出多樣化，在基因長度、外顯子等方面均有較大差

4、異。信號(hào)肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)，33個(gè) BmJHBP基因編碼一個(gè)信號(hào)肽，8個(gè)BmJHBP基因不編碼信號(hào)肽。經(jīng)過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析，家蠶BmJHBP蛋白至少含有1個(gè) JHBP結(jié)構(gòu)域，且發(fā)現(xiàn)部分 BmJHBP蛋白同時(shí)包含 JHBP和Grp7_allergen結(jié)構(gòu)域。將家蠶BmJHBP與小菜蛾P(guān)xJHBP、果蠅DmJHBP、蜜蜂AmJHBP等物種進(jìn)化分析，結(jié)果表明JHBP基因家族可以分為兩枝、四個(gè)亞家族。芯片數(shù)據(jù)和RT-PCR實(shí)驗(yàn)均表明，BmJHBP主要表

5、達(dá)于生殖腺、頭、表皮、中腸。RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，BmJHBPd2是整個(gè)家蠶JHBP基因家族中唯一在后部絲腺高量表達(dá)基因。⑵利用生物信息學(xué)分析BmJHBPd2基因，結(jié)果表明該基因全長為8053bp，包括5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，開放閱讀框（Open reading frame，ORF）長度為732bp，編碼243個(gè)氨基酸，前18個(gè)氨基酸編碼一個(gè)信號(hào)肽，剩下的氨基酸編碼一個(gè)典型的 JHBP結(jié)構(gòu)域，等電點(diǎn)為4.80，預(yù)測分子量大小為27.3k

6、D，位于23號(hào)染色體的nscaf3027區(qū)域內(nèi)。在蛋白水平上，利用Western blot方法檢測BmJHBPd2蛋白在大造5齡第3天各組織的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)BmJHBPd2高量表達(dá)于后部絲腺，這與芯片數(shù)據(jù)和RT-PCR結(jié)果一致。然后，通過RT-PCR分析BmJHBPd2在大造4齡第3天到蛹期的時(shí)期表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)BmJHBPd2在5齡1天到5天高量表達(dá)，在4齡眠期和5齡末期表達(dá)量較低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證BmJHBPd2蛋白在細(xì)胞的表達(dá)部位，構(gòu)

7、建了pSLfa1180-GFP-BmJHBPd2細(xì)胞過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至BmE細(xì)胞，采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明BmJHBPd2表達(dá)于BmE細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。利用石蠟切片和免疫熒光等方法，對BmJHBPd2在家蠶后部絲腺組織的表達(dá)部位作了定位分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白在后部絲腺的細(xì)胞質(zhì)層中高量表達(dá)，這與前面的RT-PCR、Western blot、亞細(xì)胞定位結(jié)果相一致。最后，qRT-PCR分析了BmJHBPd2在低產(chǎn)絲量品種大造和高絲量品種872的表達(dá)

8、量差異，結(jié)構(gòu)表明在5齡第3天和5齡第5天，BmJHBPd2在872的表達(dá)量明顯高于大造，暗示這可能與絲蛋白合成有關(guān)系。通過GC-MS技術(shù)對家蠶5齡第3天后部絲腺的JH做了定性檢測，質(zhì)譜結(jié)果表明，與標(biāo)準(zhǔn)品相比，在后部絲腺的同一時(shí)間檢測到JH峰，說明家蠶在5齡第3天的后部絲腺具有JH。⑶選取大造5齡第1天家蠶，沿背中線涂抹1ug的JHA。結(jié)果表明，經(jīng)JHA涂抹的家蠶，其上蔟及化蛹時(shí)間均出現(xiàn)延遲1～2天。另外，涂抹JHA之后，家蠶的經(jīng)濟(jì)性狀均

9、明顯提高。選取涂抹JHA后的12h、24h、48、72h家蠶，經(jīng)過 qRT-PCR檢測 BmJHBPd2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)家蠶在涂抹 JHA后的BmJHBPd2的表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢，說明外源JHA能夠促進(jìn)BmJHBPd2的表達(dá)。為了進(jìn)一步研究BmJHBPd2的功能，構(gòu)建了pSLfa1180-BmJHBPd2細(xì)胞過表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染至BmE細(xì)胞，qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明向培養(yǎng)基添加JHA之后，JH信號(hào)通路上的早期因子Kr-h1顯著上調(diào)表達(dá)，說明