水稻白葉枯病菌轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Clpxoo的cNMP受體和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的功能初探.pdf

1、由黃單胞菌水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,簡(jiǎn)稱Xoo)引起的水稻白葉枯病是世界上重要的水稻細(xì)菌性病害之一。Xoo在與水稻互作過(guò)程中需要一系列信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)機(jī)制調(diào)控對(duì)寄主植物的侵染。然而,這些信號(hào)調(diào)控機(jī)制對(duì)細(xì)菌毒性的確切功能尚不完全清晰。研究表明,環(huán)鳥(niǎo)苷二磷酸(c-di-GMP)是廣泛存在于各類細(xì)菌中的第二信使,調(diào)控細(xì)菌多方面的生物學(xué)功能。本室在解析Xoo的c-di-GMP信號(hào)途徑及其功能方面已開(kāi)展了

2、一些基礎(chǔ)性研究工作。前期研究表明,轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Clpxoo是推導(dǎo)的c-di-GMP信號(hào)受體蛋白,在Xoo中調(diào)控了胞外多糖產(chǎn)生、生物膜形成、菌體沉降、H2O2敏感性和對(duì)水稻的致病性等性狀。然而,對(duì)Clpxoo的作用機(jī)理尚不明了。因此,本研究重點(diǎn)對(duì)Clpxoo的cNMP結(jié)合結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(HTH)進(jìn)行了初步的功能解析,主要開(kāi)展了以下工作:
　　 (1)利用表達(dá)載體pET28a(+)成功誘導(dǎo)表達(dá)了Clpxoo蛋白,并通過(guò)Ni

3、2+離子交換樹(shù)脂進(jìn)行蛋白純化,得到了純度較高的非變性目的蛋白。
　　 (2)采用qRT-PCR方法,定量測(cè)定△clpxoo中調(diào)控鞭毛運(yùn)動(dòng)性的σ54因子編碼基因rpoNxoo及內(nèi)聚葡糖酶編碼基因engXCAxoo的轉(zhuǎn)錄本表明,Clpxoo正調(diào)控rpoNxoo和engXCAxoo的表達(dá)。采用生物信息學(xué)方法,預(yù)測(cè)其啟動(dòng)子區(qū)域可能具有Clpxoo結(jié)合的保守序列,分別在rpoNxoo和engXCAxoo距翻譯起始位點(diǎn)上游187bp和318

4、bp處,二者序列相似性分別為60％和80％。采用生物素化學(xué)發(fā)光凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA),檢測(cè)Clpxoo蛋白與rpoNxoo、engXCAxoo啟動(dòng)子區(qū)及大腸桿菌中Crp所結(jié)合的特異寡核苷酸片段H的相互作用,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Clpxoo蛋白與上述基因啟動(dòng)了片段無(wú)阻滯現(xiàn)象發(fā)生,表明Clpxoo與上述基因啟動(dòng)子區(qū)無(wú)結(jié)合作用,推測(cè)Clpxoo對(duì)它們起間接調(diào)控作用。
　　 (3)通過(guò)等溫滴定量熱實(shí)驗(yàn)(ITC),對(duì)Clpxoo蛋白與c-di—GM

5、P的反應(yīng)熱量進(jìn)行了初步監(jiān)測(cè)。初步確定Clpxoo蛋白結(jié)合c-di-GMP,兩者之間有相互作用,推測(cè)Clpxoo蛋白是c-di-GMP的新受體蛋白。
　　 (4)利用不同的表達(dá)載體,對(duì)與c-di-GMP信號(hào)途徑相關(guān)基因PXO01019、PXO03877及PXO_04753進(jìn)行了原核表達(dá)。利用pET28a(+)原核表達(dá)了。PXO_01019蛋白,用pET32a(+)和pGEX-4T-1原核表達(dá)了PXO_03877及PXO_04753