水稻白葉枯病菌一個(gè)具有LRR結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)的Ⅲ型效應(yīng)物基因的功能研究.pdf

1、水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，簡稱Xoo)屬于革蘭氏陰性細(xì)菌，是水稻黃單胞菌的致病變種之一，主要從水稻葉片水孔與傷口侵入，在維管束中定殖，引起水稻白葉枯病。水稻白葉枯病菌寄主特異性較強(qiáng)，主要侵染水稻及茭白等，導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收。在分子植物病理學(xué)中，水稻白葉枯病菌與水稻之間有典型的基因?qū)蚧プ麝P(guān)系，被認(rèn)為是研究植物與病原微生物互作的重要模式研究系統(tǒng)。研究表明，由Ⅲ型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)的Ⅲ型效應(yīng)物在病原

2、菌致病過程中發(fā)揮了主導(dǎo)作用，Ⅲ型效應(yīng)物是通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)進(jìn)入植物體中的蛋白分子，在病原微生物與植物互作中發(fā)揮重要作用。通過同源比較，發(fā)現(xiàn)水稻黃單胞菌菲律賓菌株P(guān)XO99A中PXO_03420基因編碼的HpaF蛋白與羅爾斯氏菌的Ⅲ型效應(yīng)物蛋白PopC結(jié)構(gòu)相似。進(jìn)一步通過SMART(Simple Modular Architecture Research Tool，簡稱SMART)軟件進(jìn)行該基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)PXO_03420(Hpa

3、F)具有三個(gè)富亮氨酸(Leucine-Rich Repeat，簡稱LRR)結(jié)構(gòu)域。生物信息學(xué)分析與相關(guān)研究表明，蛋白的LRR結(jié)構(gòu)域往往與蛋白-蛋白間互作相關(guān)，并參與病原菌的致病與植物的抗病過程，在植物與病原菌互作中發(fā)揮了一定作用。為了研究PXO_03420(hpaF)基因的功能，通過缺失突變，構(gòu)建了該基因的缺失突變體，表型分析和植株試驗(yàn)結(jié)果顯示該突變體的游動(dòng)性與致病力顯著下降(游動(dòng)性較野生型降低了46.62%，致病力較野生型降低了51.

4、81%)，同時(shí)，突變體在非寄主蓖麻上引起過敏反應(yīng)時(shí)間延遲。用帶有PXO_03420基因全長ORF的pLAFR3，能夠互補(bǔ)突變體的游動(dòng)性能力和致病力，致敏能力也得到恢復(fù)，表明該基因與水稻白葉枯病菌的游動(dòng)性、致病性和致敏性有關(guān)。
　　 采用MEGA5建樹軟件對(duì)PXO_03420(hpaF)基因的進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果表明多數(shù)與PXO_03420基因親緣關(guān)系近的同源基因均屬于已被證明的Ⅲ型效應(yīng)物基因。為了研究PXO_03420(hpa

5、F)基因在在日本晴水稻中的互作關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)采用了酵母雙雜交法初步篩選了PXO_03420在水稻中的靶標(biāo)蛋白。采用了經(jīng)典的SMARTTM(switching mechanism at5'end ofRNA transcript)法構(gòu)建日本晴水稻葉片高質(zhì)量cDNA文庫，文庫重組率為87.6%，豐度為2.57×106 pfu/mL，完全達(dá)到了酵母雙雜交的文庫基本要求。將文庫與構(gòu)建的AH109/pGBKT7_03420誘餌進(jìn)行互作，通過對(duì)所得結(jié)