水稻白葉枯病菌PXO99A中tal4基因功能研究.pdf

1、由稻黃單胞水稻致病變種(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)引起的白葉枯病是一種最具破壞性的水稻細(xì)菌病害。類似轉(zhuǎn)錄激活子效應(yīng)蛋白(Transcription activator-likeeffector，TALE)是Xoo在侵染植物后通過(guò)三型泌出通道泌出的一類蛋白，TALE的編碼基因稱為tal基因。根據(jù)基因組序列，Xoo菌株P(guān)XO99A基因組中含19個(gè)tal基因。tal4是其中一個(gè)功能未知的基因。
　

2、　本研究中采用基于同源交換的基因敲除方法構(gòu)建了PXO99A tal4基因的缺失突變菌株，并對(duì)該基因缺失突變菌株進(jìn)行功能互補(bǔ)。通過(guò)研究tal4基因缺失突變菌株在寄主水稻上的毒力，對(duì)溫度、鹽、酸堿等脅迫的反應(yīng)及對(duì)殺菌劑敏感性變化來(lái)解析tal4基因的功能，并對(duì)tal4基因抗藥性機(jī)制進(jìn)行了初步探究。
　　首先通過(guò)重疊延伸PCR的方法構(gòu)建了用于tal4缺失突變的重組體ptal4-KD，將其導(dǎo)入PXO99A后，篩選抗卡那霉素的PXO99A轉(zhuǎn)化

3、子。利用PCR驗(yàn)證法篩選發(fā)生雙交換的缺失突變菌株P(guān)XO99△tal4。將PXO99A中的tal4編碼基因的粘粒通過(guò)冷凍轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入PXO99△tal4中，獲得tal4基因缺失突變菌株的功能互補(bǔ)菌株C-△tal4。
　　PXO99△tal4接種寄主植物水稻后，形成的病斑長(zhǎng)度及在水稻中的增殖能力與PXO99A、C-△tal4相比無(wú)顯著性差異。PXO99△tal4對(duì)溫度、鹽和酸堿等脅迫的反應(yīng)也沒(méi)有被改變。而在噴施噻枯唑的水稻上和含噻枯唑的

4、NA平板上，PXO99△tal4對(duì)噻枯唑的敏感性較PXO99A明顯增強(qiáng)，噻枯唑?qū)XO99△tal4的最低抑制濃度(MinimalInhibitory Concentration，MIC)為70μg/mL，顯著低于對(duì)PXO99A的最低抑制濃度110μg/mL;噻枯唑?qū)XO99△tal4的抑制中濃度EC50值是PXO99A的77.9％。tal4基因可以恢復(fù)PXO99△tal4對(duì)噻枯唑的敏感性至PXO99A水平。
　　通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定

5、量PCR檢測(cè)菌株中與抗藥性相關(guān)的核糖體RNA16S(RibosomalRNA16S，rrs)和30S核糖體蛋白S12(30S ribosomal subunit protein S12，rpsL)基因的表達(dá)情況。與PXO99A相比，tal4基因缺失后Xoo中rrs的表達(dá)量顯著下降，僅為PXO99A的38％，而rpsL基因的表達(dá)量與PXO99A沒(méi)有顯著差異。采用同源雙交換的方法敲除了PXO99A中rrs基因，rrs基因缺失突變菌株P(guān)XO9

6、9△rrs表現(xiàn)出對(duì)噻枯唑敏感性增強(qiáng)的表型。
　　上述結(jié)果研究表明:tal4基因缺失不影響PXO99A在水稻上的毒力和對(duì)溫度、滲透壓及酸堿脅迫的反應(yīng);tal4基因在PXO99A對(duì)殺菌劑噻枯唑的抗性中起重要作用;tal4基因突變導(dǎo)致PXO99A中抗藥相關(guān)基因rrs的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著性變化;tal4基因可能是通過(guò)影響菌株中抗藥基因rrs的表達(dá)來(lái)影響菌株對(duì)噻枯唑的抗性。本研究首次發(fā)現(xiàn)水稻白葉枯病菌效應(yīng)蛋白基因tal參與了病原菌對(duì)殺菌劑噻枯