E1A激活基因阻遏子基因調(diào)控血管外膜成纖維細胞表型轉(zhuǎn)化及其機制研究.pdf

1、傳統(tǒng)的觀念認為病理性血管重構(gòu)的發(fā)生是一個“由內(nèi)而外”的過程,由內(nèi)管內(nèi)皮細胞損傷始動,繼而血管平滑肌細胞(vascularsmoothmusclecells,VSMCs)增殖,并合成、分泌大量細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)蛋白,最終導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)和功能的改變。然而,通過抑制內(nèi)皮損傷和對抗VSMCs增殖來進行的治療性研究并沒有完全阻斷病理性血管重構(gòu)的發(fā)生。近年來,血管外膜在血管重塑中的作用越來越受到人們的重視,并

2、且提出“由外而內(nèi)”的血管損傷重構(gòu)假說,其中心觀點認為血管損傷發(fā)生后,外膜是血管壁的第一感知部位。無論血管損傷是否累及外膜(嚴重與否),對損傷反應(yīng)活躍的細胞最先出現(xiàn)于血管外膜。血管外膜成纖維細胞(adventitialfibroblasts,AFs)是血管外膜中最主要的細胞成分,其在各種病理性損傷刺激下轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞(myofibroblasts,MFs),MFs是一種具有平滑肌細胞特征的成纖維細胞,表達平滑肌肌動蛋白-α(smoot

3、hmuscleα-actin,α-SMA),可以產(chǎn)生ECM和多種生物活性因子,MFs增殖并遷移至中膜和內(nèi)膜,參與新生內(nèi)膜形成及血管重塑過程。
　　E1A激活基因阻遏子(cellularrepressorofE1A-stimulatedgenes,CREG)是一個新近發(fā)現(xiàn)的血管穩(wěn)態(tài)調(diào)控因子,其在成熟分化的組織和細胞中廣泛表達,但在去分化組織或細胞,如鼠胚胎干細胞、人畸胎瘤細胞、造血干細胞和去分化表型VSMCs中卻呈明顯低表達或無表達

4、狀態(tài)。CREG可直接與外源性腺病毒蛋白E1A及哺乳動物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子E2F家族蛋白競爭性地結(jié)合在靶基因的啟動子上,從而阻遏E1A和E2F對靶基因的激活作用,因而推測CREG可能通過與E1A、E2F競爭性抑制作用而起到促進細胞分化、抑制細胞增殖的作用。研究發(fā)現(xiàn),在無特異性誘導(dǎo)劑存在的情況下,CREG仍可以單獨誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的畸胎瘤細胞向神經(jīng)細胞分化。另外,CREG還具有維持心肌細胞和小腸上皮細胞成熟穩(wěn)態(tài)、對抗病理性細胞損傷發(fā)生的生物學功能。本

5、實驗室前期系列研究證實,CREG基因在成熟分化的VSMC中大量表達,能夠維持VSMC分化、阻遏在體損傷后VSMC向去分化表型轉(zhuǎn)化并抑制新生內(nèi)膜形成。因此,CREG是參與維持組織及細胞成熟分化穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)控因子。
　　絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPKs)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是生物體內(nèi)廣泛存在的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶,參與介導(dǎo)細胞生長、發(fā)育、分裂和分化等多種生理及病理過程。在哺乳動物

6、細胞中MAPKs亞族主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignalregulatedproteinkinase1/2,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Junamino-terminalkinase1/2,JNK1/2)和p38-MAPK。我們研究室前期在研究CREG調(diào)控人VSMCs凋亡過程時發(fā)現(xiàn),CREG過表達通過抑制JNK1/2和p38-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活來阻止藥物誘導(dǎo)的離體培養(yǎng)的人VSMC

7、s凋亡,同時,外源性添加CREG蛋白也能夠抑制JNK1/2和p38-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活來緩解球囊損傷誘導(dǎo)的人冠狀動脈血管中VSMCs的凋亡。另外,關(guān)于CREG基因的其他研究小組也相繼證實,CREG抑制心肌肥厚、纖維化和炎癥作用的機制與ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路密切相關(guān)。綜上所述,CREG可作為MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游調(diào)控子來影響多種組織細胞的生物學行為。
　　本研究擬在整體和細胞兩個水平復(fù)制AFs細胞表型轉(zhuǎn)化模型,運用形

8、態(tài)學、細胞生物學、分子生物學等技術(shù),圍繞血管損傷后CREG基因表達對血管外膜增生、AFs細胞表型轉(zhuǎn)化,以及MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中發(fā)揮的調(diào)控作用等方面的問題進行研究,以期通過闡明CREG基因?qū)Fs細胞表型轉(zhuǎn)化的調(diào)控作用及其機制,為拓展防治血管重塑性疾病的新思路奠定基礎(chǔ)。
　　本課題的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　1.CREG基因表達與AFs表型轉(zhuǎn)化間的相關(guān)性研究。
　　采用小鼠頸動脈血管損傷模型,免疫熒光染色觀察

9、血管損傷后外膜中α-SMA表達變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn),α-SMA僅在正常血管中膜表達,外膜沒有表達,損傷1d后血管外膜開始增生,并有少量α-SMA表達,提示開始有AFs轉(zhuǎn)化為MFs,損傷3d后血管外膜增生最明顯,α-SMA在外膜中大量表達,而在損傷7d和14d后,外膜增生程度有所緩解,α-SMA的表達也逐漸減少;正常血管外膜大量表達CREG蛋白,損傷1d后CREG在外膜中的表達開始減少,損傷3d后外膜中幾乎沒有CREG表達,而在損傷7d和14d

10、后CREG在血管外膜中的表達逐漸恢復(fù)。由此可見,損傷血管外膜中CREG的表達變化與α-SMA的表達呈負相關(guān)關(guān)系。
　　采用貼壁法培養(yǎng)C57BL/6小鼠胸主動脈AFs,免疫熒光染色鑒定培養(yǎng)細胞的類型,發(fā)現(xiàn)其胞膜上不表達內(nèi)皮細胞標志物CD31和VIII因子,胞漿內(nèi)也不表達VSMCs標志物desmin和α-SMA,但表達波形蛋白(vimentin),說明細胞是間質(zhì)性來源,同時排除內(nèi)皮細胞和VSMCs的參雜,可以確定培養(yǎng)的細胞為AFs。<

11、br>　　采用血管緊張素II(angiotensinII,AngII)作為誘發(fā)AFs表型轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)劑,觀察AngII誘發(fā)AFs表型轉(zhuǎn)化過程中CREG表達變化。Western-Blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),給予不同濃度AngII(0、10nM、100nM、1μM和10μM)刺激24h或者給予1μMAngII刺激不同時間(0h、12h、24h、48h、72h、96h和120h)后,AFs表達α-SMA逐漸增多,并且表現(xiàn)出時間和劑量依賴性特點;同時,1μ

12、M和10μMAngII刺激24h后,AFs中CREG的表達量分別減少45.5％(p<0.01)和75.8%(p<0.01);AngII刺激后CREG的表達變化也表現(xiàn)為時間依賴性,1μMAngII刺激24h后CREG的表達減少31.5%(p<0.01),隨著刺激時間的延長,CREG表達量逐漸減少,至120h后減少達98.9%(p<0.01)。應(yīng)用AngII1型受體阻斷劑EMD66684(10μM),AngII誘發(fā)AFs表型轉(zhuǎn)化及CREG表

13、達下調(diào)的作用消失,而應(yīng)用AngII2型受體阻斷劑PD123319(10μM)對AngII誘發(fā)的AFs表達α-SMA增加和表達CREG減少現(xiàn)象無影響,說明AngII通過與其1型受體相互作用誘導(dǎo)AFs轉(zhuǎn)化為MFs,同時下調(diào)細胞中CREG的表達。
　　以上在體和離體實驗均表明,AFs表型轉(zhuǎn)化過程中CREG表達下調(diào),提示CREG基因表達可能與AFs表型轉(zhuǎn)化相關(guān)。
　　2.CREG基因過表達抑制AngII誘導(dǎo)的AFs表型轉(zhuǎn)化。

14、　　采用腺病毒載體轉(zhuǎn)染法制備CREG基因過表達的小鼠原代AFs模型,應(yīng)用AngII(1μM,24h)誘發(fā)AFs表型轉(zhuǎn)化,免疫熒光染色結(jié)果顯示,AngII誘導(dǎo)正常對照組和轉(zhuǎn)染對照組中AFs表達α-SMA增多,而CREG基因過表達組能夠?qū)笰ngII誘導(dǎo)的AFs表型轉(zhuǎn)化。Western-blot結(jié)果表明,應(yīng)用AngII刺激后AFs中表達α-SMA明顯增多(與正常對照組相比,719.4%±7.5%,p<0.01,n=3),但表達CREG明顯減

15、少(與正常對照組相比,67.6%±5.5%,p<0.05,n=3),CREG基因過表達能夠上調(diào)AFs中CREG的表達(與Ad-GFP+AngII刺激組相比,220%±4.8%,p<0.01,n=3),同時抑制AngII誘導(dǎo)的α-SMA表達增多(與Ad-GFP+AngII刺激組相比,21.6%±4.7%,p<0.01,n=3)。以上提示CREG基因過表達可以抑制AngII誘導(dǎo)的AFs表型轉(zhuǎn)化。
　　AFs受到AngII刺激后轉(zhuǎn)化為M

16、Fs,同時其增殖和遷移能力增強。為了進一步驗證CREG具有調(diào)控AFs表型轉(zhuǎn)化的作用,我們分別采用細胞計數(shù)、BrdU免疫組化染色和流式細胞周期分析的方法,檢測CREG基因過表達對AngII誘導(dǎo)的AFs增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):腺病毒載體介導(dǎo)CREG基因轉(zhuǎn)染AFs后2~4dCREG蛋白表達水平明顯升高(與未轉(zhuǎn)染組相比,2d,197.6%±33.5%,p<0.05,n=3;3d,482.7%±90.6%,p<0.01,n=3;4d,269.6%±

17、52.4%,p<0.01,n=3),CREG基因轉(zhuǎn)染后2~5d,AngII誘導(dǎo)的AFs增殖被顯著抑制(與Ad-GFP+AngII刺激組相比,2d,66.7%±9.7%,p<0.05,n=3;3d,63.3%±7.1%,p<0.01,n=3;4d,71.2%±5.4%,p<0.01,n=3;5d,77.5%±6.6%,p<0.01,n=3),CREG基因轉(zhuǎn)染后6~12d,AFs增殖情況與對照組相比無明顯差異;BrdU免疫組化染色顯示,應(yīng)用

18、AngII(1μM,24h)刺激后,BrdU染色陽性細胞比例明顯升高,而CREG基因過表達可顯著降低BrdU陽性細胞比例(正常對照組為12.5%±7.3%,AngII處理組為76.3%±9.7%,Ad-GFP+AngII處理組為70.9%±11.4%,Ad-CREG+AngII處理組為22.6%±6.8%;AngII處理組與正常對照組相比,p<0.01,n=3;Ad-CREG+AngII處理組與Ad-GFP+AngII處理組相比,p<0

19、.01,n=3);流式細胞周期分析發(fā)現(xiàn),應(yīng)用AngII(1μM,24h)刺激后,G0/G1期細胞百分比明顯降低,進入S期細胞比例明顯升高,而CREG基因過表達可顯著抑制AFs由G0/G1期進入S期(正常對照組G0/G1期細胞百分比為54.9%±6.3%,S期細胞百分比為2.4%±2.2%;AngII處理組G0/G1期細胞百分比為41.8%±2.9%,S期細胞百分比為27.1%±5.4%;Ad-GFP+AngII處理組G0/G1期細胞百分

20、比為43.1%±5.8%,S期細胞百分比為26.3%±4.3%;Ad-CREG+AngII處理組G0/G1期細胞百分比為50.5%±4.5%,S期細胞百分比為6.3%±4.3%;AngII處理組與正常對照組相比,p<0.01,n=4;Ad-CREG+AngII處理組與Ad-GFP+AngII處理組相比,p<0.01,n=4)。上述研究結(jié)果提示CREG基因過表達可抑制AngII誘導(dǎo)的AFs增殖。
　　接下來,我們分別采用劃痕實驗和T

21、ranswell細胞遷移模型檢測CREG基因過表達對AngII誘導(dǎo)的AFs遷移的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在AngII的趨化作用下,AFs遷移活性明顯增強,表現(xiàn)為劃痕區(qū)域的細胞覆蓋數(shù)目增加(1μMAngII,24h),遷移至Transwell下室的細胞數(shù)目增多(1μMAngII,6h),而CREG基因過表達明顯減少劃痕區(qū)域的細胞覆蓋數(shù)目(進入無細胞區(qū)的細胞數(shù):正常對照組為21±5個,AngII處理組為47±4個,Ad-GFP+AngII處理組為5

22、0±7個,Ad-CREG+AngII處理組為33±5個;AngII處理組與正常對照組相比,p<0.01,n=3;Ad-CREG+AngII處理組與Ad-GFP+AngII處理組相比,p<0.01,n=3)和Transwell下室細胞數(shù)目(正常對照組為16.5±2.5個,AngII處理組為44.2±5.5個,Ad-GFP+AngII處理組為47.4±4.8個,Ad-CREG+AngII處理組為25.7±4.2個;AngII處理組與正常對照