E1A激活基因阻遏子(CREG)調(diào)控人血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的膜受體機(jī)制.pdf

1、目的：動脈粥樣硬化（atherosclerosis,AS）和經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention,PCI)術(shù)后再狹窄（restenosis,RS）等增生性血管疾病是目前威脅人類健康最嚴(yán)重的疾病之一，研究其防治策略具有重要意義。近年研究發(fā)現(xiàn)，成熟血管壁的血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells,VSMC）具有極大可塑性。生理狀態(tài)下血管壁中VSMC處于分化

2、表型，血管損傷后，VSMC可發(fā)生表型逆轉(zhuǎn)，由分化表型（收縮表型）轉(zhuǎn)變?yōu)槿シ只硇停ê铣杀硇停@得增殖、遷移及合成、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)的能力。VSMC由分化表型向去分化表型的轉(zhuǎn)化是AS及PCI術(shù)后RS等疾病發(fā)生中新生內(nèi)膜形成和管腔狹窄的重要病理基礎(chǔ)。因此，對VSMC表型轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究是增生性血管病防治研究的一個重要方向。
　　1998年，Gill等研究提示，人E1A激活基因阻遏子基因（cellular repressor of

3、E1A-stimulated genes,CREG）可以誘導(dǎo)細(xì)胞的分化和成熟，并參與成熟組織中細(xì)胞分化狀態(tài)的維持。我室自1999年應(yīng)用mRNA差異顯示技術(shù)首次從體外培養(yǎng)的人胸廓內(nèi)動脈血管平滑肌細(xì)胞（Human internal thoracic artery smooth muscle cell，，HITASY）中克隆出了人CREG基因，并證實(shí)CREG表達(dá)與VSMC分化呈高度相關(guān)，提示CREG參與了體外培養(yǎng)的VSMC由增殖表型向分化表型

4、轉(zhuǎn)化。但是CREG作為分泌型蛋白質(zhì)，其誘導(dǎo)VSMC分化和抑制VSMC增生的機(jī)制尚待闡明。Gill實(shí)驗(yàn)室通過FarWestern分析提示，CREG可與細(xì)胞膜上的甘露糖6磷酸/胰島素樣生長因子II受體（mannose-6-phosphate/insulin-like growth factor Ⅱ receptor，M6P/IGF2R）發(fā)生相互作用，在人畸胎瘤細(xì)胞中發(fā)揮抑制增殖和/或促進(jìn)分化的作用，并證實(shí)CREG與M6P/IGF2R的相互作

5、用是通過CREG蛋白的糖基化位點(diǎn)介導(dǎo)的。為明確M6P/IGF2R在CREG調(diào)控VSMC分化中的作用，本室進(jìn)行了相關(guān)的預(yù)實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)用蛋白磷酸酶PP2A的特異性抑制劑崗田酸（okadaic acid）處理VSMC后，細(xì)胞膜表面M6P/IGF2R減少，從而使外源性CREG蛋白誘導(dǎo)的VSMC分化受到抑制，提示膜受體蛋白M6P/IGF2R可能參與了CREG對VSMC分化的調(diào)控。本研究將著重闡明M6P/IGF2R是否介導(dǎo)了CREG蛋白的生物學(xué)功

6、能，CREG與M6P/IGF2R之間是否發(fā)生直接相互作用、相互作用的結(jié)合位點(diǎn)及其與CREG蛋白分子中糖基化結(jié)構(gòu)的關(guān)系。
　　方法：
　　(1)用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增終止密碼突變的人CREG開放讀碼框，構(gòu)建含有myc和His標(biāo)簽的野生型CREG（wtCREG）真核表達(dá)載體pcDNA3.1 myc-His/wtCREG，以及3個糖基化位點(diǎn)（第160,193和216位的Asn殘基）全部突變?yōu)锳la殘基的去糖基化突變型CREG(mC

7、REG)真核表達(dá)載體pcDNA3.1 myc-His/mCREG。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染人293F細(xì)胞株，用G418篩選出穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞克隆，大量擴(kuò)增后提取細(xì)胞蛋白，用Ni-NTA親合層析方法純化，并進(jìn)行糖苷酶切和Western blot檢測鑒定，得到野生型和糖基缺失突變的CREG蛋白（wtCREG和mCREG），并通過與標(biāo)準(zhǔn)品白蛋白對比，計算出純化蛋白的濃度；
　　(2）將純化得到的重組wtCREG及mCREG

8、蛋白以不同濃度，加入本室保存的人胸廓內(nèi)動脈VSMC系（簡稱為HITASY細(xì)胞）和HITASY細(xì)胞衍生的、經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的、shCREG干擾后CREG蛋白低表達(dá)的人VSMC（簡稱為OB2細(xì)胞）培養(yǎng)液中，應(yīng)用流式細(xì)胞分析方法檢測細(xì)胞增殖情況，比較兩種CREG蛋白對細(xì)胞增殖效應(yīng)的調(diào)控作用，確定兩種蛋白調(diào)控人VSMC生物學(xué)行為的最適濃度。將最適濃度的兩種蛋白質(zhì)分子分別加入HITASY和OB2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，應(yīng)用細(xì)胞流式分析、Western

9、blot、細(xì)胞刮傷實(shí)驗(yàn)、明膠酶電泳分析等方法觀察兩種重組人CREG蛋白對人VSMC增殖、遷移、分化等生物學(xué)行為的影響；通過不同濃度（2，4，8μg/μL）的M6P/IGF2R抗體阻斷實(shí)驗(yàn)、免疫熒光雙染色和免疫共沉淀等檢測方法，分析CREG蛋白是否與M6P/IGF2R存在直接結(jié)合，進(jìn)一步明確M6P/IGF2R介導(dǎo)兩種CREG蛋白質(zhì)生物學(xué)功能；
　　(3）進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR合成M6P/IGF2R細(xì)胞外不同結(jié)構(gòu)域（M6P/IGF2R

10、-1：1～3結(jié)構(gòu)域；M6P/IGF2R-2：4～6結(jié)構(gòu)域；M6P/IGF2R-3：7～10結(jié)構(gòu)域）cDNA片段，并構(gòu)建帶有His標(biāo)簽的PQE31-M6P/IGF2R-1,2,3載體，在大腸桿菌JM109菌株中表達(dá)，通過Ni-NTA親合層析純化得到人M6P/IGF2R胞外結(jié)構(gòu)域蛋白小肽。進(jìn)一步應(yīng)用SDS-PAGE電泳和Western blot鑒定純化蛋白的準(zhǔn)確性，并通過與標(biāo)準(zhǔn)品白蛋白對比，計算出純化蛋白的濃度。應(yīng)用固相吸附實(shí)驗(yàn)，檢測固化的

11、M6P/IGF2R（R&D Systems）胞外結(jié)構(gòu)域(其中11～15號結(jié)構(gòu)域—IGF2R-4—從R&D公司購買)與純化的wt/mCREG的直接結(jié)合，并通過Scatchard分析計算離解常數(shù)（KD值）。分別應(yīng)用M6P和6-磷酸葡糖糖（glucose 6-phosphate，G6P）進(jìn)行體外競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定CREG蛋白與M6P/IGF2R相互作用是否與蛋白的糖基化有關(guān)。將與wt/mCREG蛋白高親合的M6P/IGF2R胞外重組小

12、肽片段分別添加到細(xì)胞培養(yǎng)上清中，確定wt/mCREG蛋白對VSMC生物學(xué)行為的調(diào)控作用（流式細(xì)胞分析檢測細(xì)胞增殖、刮傷實(shí)驗(yàn)和明膠酶譜分析細(xì)胞遷移能力）是否通過其與M6P/IGF2R小肽的直接親合作用介導(dǎo)。
　　結(jié)果：
　?。?）制備并純化得到重組的人wtCREG/myc-His和mCREG/myc-His標(biāo)簽蛋白：
　　1）RT-PCR擴(kuò)增出終止密碼突變的人CREGcDNA片段，插入PMD-18T載體中，經(jīng)酶切及測序證

13、實(shí)插入片段序列正確；用BamHI/EcoRI雙酶切將CREGcDNA片段亞克隆至pcDNA3.1 myc-His真核表達(dá)載體中，構(gòu)建完成pcDNA3.1 myc-His/wtCREG重組質(zhì)粒，測序確定插入序列正確；將生工公司合成的氨基酸突變的CREGcDNA片段經(jīng)BamHI/EcoRI酶亞克隆至pcDNA3.1 myc-His真核表達(dá)載體中，構(gòu)建完成pcDNA3.1 myc-His/mCREG重組質(zhì)粒，測序確定插入序列正確；
　　

14、2）將構(gòu)建完成的pcDNA3.1 myc-His/wt/mCREG重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人293F工程細(xì)胞株中，通過G418抗性篩選獲得高表達(dá)CREG蛋白的抗性克隆。大量擴(kuò)增克隆細(xì)胞株，收集細(xì)胞后進(jìn)行裂解提取細(xì)胞中蛋白質(zhì)，經(jīng)Ni-NTA親合層析純化獲得重組人wtCREG/myc-His和人mCREG/myc-His標(biāo)簽蛋白。經(jīng)糖苷酶切和Western blot檢測證實(shí)分別為含有糖基結(jié)構(gòu)的CREG和去糖基突變型的CREG蛋白；SDS-PAGE電泳

15、確定重組蛋白質(zhì)的分子量，與標(biāo)準(zhǔn)品白蛋白對比，計算出純化的重組蛋白濃度分別為0.893μg/μL和0.972μg/μL，純度為92％和93％。
　?。?）兩種重組CREG蛋白生物學(xué)效應(yīng)檢測及其細(xì)胞膜表面受體機(jī)制：
　　1）最適宜效應(yīng)濃度分析：將兩種純化的重組CREG蛋白稀釋成不同濃度（200、400、800、1600nM），加入經(jīng)去血清培養(yǎng)72h進(jìn)行同步化的HITASY和OB2細(xì)胞培養(yǎng)上清中，8h后收集細(xì)胞用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞

16、周期，結(jié)果顯示：各組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例均有所增加，添加wtCREG蛋白組作用更加明顯，而且兩種CREG蛋白發(fā)揮生物學(xué)功能的最佳濃度均為400nM。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：兩種重組CREG蛋白對VSMC增殖均有劑量依賴性的抑制作用，并且相同濃度的糖基化的CREG蛋白對細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)更為顯著，最佳效應(yīng)濃度為400nM；
　　2）兩種重組CREG蛋白添加后對HITASY和OB2細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：
　?、貱REG蛋白對VSM

17、C遷移的影響：刮傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入最佳效應(yīng)濃度的wtCREG和mCREG蛋白24h后，OB2組遷移能力下降，HITASY組無明顯變化；細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶-2,9（Matrix metallo-proteinase 2,9，MMP2,9）明膠酶電泳檢測和Western blot檢測結(jié)果證實(shí)，兩種CREG蛋白均可以使OB2細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)MMP2,9減少，而組織金屬蛋白酶抑制物（Tissue Inhibitors of Metallopr

18、oteinases,TIMPs)增加；
　　②CREG蛋白對VSMC分化的影響：加入400nM的wtCREG和mCREG蛋白12h后，OB2細(xì)胞myocardin、SMα-actin、MHC、caldesmin表達(dá)增加，LM-1、FN表達(dá)減少；
　?、哿魇郊?xì)胞儀分析細(xì)胞周期和BrDU染色分析證實(shí)，加入400nM的wtCREG和mCREG蛋白后，OB2組G0/G1期細(xì)胞由0.5308分別增加至0.5773和0.5572，HIT

19、ASY組G0/G1期細(xì)胞由0.6297分別增加至0.7369和0.7034。
　　3）M6P/IGF2R在重組CREG蛋白的生物學(xué)功能中的調(diào)控作用：
　?、倜庖吖渤恋砗兔庖邿晒怆p染色分析結(jié)果顯示，CREG蛋白與M6P/IGF2R存在直接結(jié)合；
　?、趹?yīng)用抗體阻斷實(shí)驗(yàn)：將不同濃度的anti-M6P/IGF2R（2、4、8μg/mL）與兩種CREG蛋白同時加入培養(yǎng)液中，CREG蛋白抑制VSMC增值、遷移和合成細(xì)胞外基質(zhì)、促

20、進(jìn)分化的效應(yīng)減弱，而且與加入anti-M6P/IGF2R濃度正相關(guān)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：兩種重組CREG蛋白對體外培養(yǎng)的HITASY和OB2細(xì)胞向分化表型轉(zhuǎn)化有明顯的促進(jìn)作用，同時抑制細(xì)胞的增殖、遷移和合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力，并且兩種重組CREG蛋白對VSMC生物學(xué)行為的調(diào)控均可被M6P/IGF2R中和抗體阻斷，CREG蛋白與M6P/IGF2R存在直接結(jié)合。
　?。?）與兩種重組CREG蛋白相互作用的M6P/IGF2R結(jié)構(gòu)域分析：

21、r>　　1）RT-PCR擴(kuò)增含有不同結(jié)構(gòu)域M6P/IGF2RcDNA片段，插入PMD18-T載體中，測序確定插入片段序列準(zhǔn)確。用SphI/SalI雙酶切將M6P/IGF2RcDNA片段亞克隆至PQE31-His原核表達(dá)載體中，構(gòu)建完成重組質(zhì)粒，測序確定插入序列正確；載體質(zhì)粒感染大腸桿菌JM109菌株后擴(kuò)增，并通過Ni-NTA親合層析純化獲得原核表達(dá)蛋白，SDS-PAGE分析確定重組蛋白的分子量分別為：54kD（IGF2R-1），44kD

22、（IGF2R-2），62kD(IGF2R-3)。Western blot分析證實(shí)所獲得的M6P/IGF2R-1,2,3重組蛋白均為M6P/IGF2R和His標(biāo)簽重組蛋白，并將三種重組蛋白的濃度均調(diào)整為10nM。ELISA分析結(jié)果證實(shí)：重組wtCREG蛋白與IGF2R-3和IGF2R-4具有高結(jié)合力，KD值分別為0.1063pM和0.2106pM；重組的mCREG蛋白與M6P/IGF2RIGF2R-4存在高親和力，KD值為6.488pM；

23、其中wtCREG與M6P/IGF2R-3/IGF2R-4結(jié)合作用可以被M6P競爭抑制；
　　2)將不同濃度的M6P/IGF2R的第11～15結(jié)構(gòu)域和第7～10結(jié)構(gòu)域小肽片段與兩種重組CREG蛋白共同加入體外培養(yǎng)的OB2細(xì)胞中,觀察重組CREG蛋白對OB2增殖和遷移的效應(yīng)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn):wtCREG和mCREG對細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用均被M6P/IGF2R的第11～15結(jié)構(gòu)域小肽阻斷,而第7～10結(jié)構(gòu)域小肽片段僅對wtCREG蛋白

24、的生物學(xué)效應(yīng)有明顯的阻斷作用,對mCREG的生物學(xué)作用無效。
　　結(jié)論：CREG可以作為分泌型蛋白,通過細(xì)胞膜表面M6P/IGF2R蛋白抑制VSMC的增殖、遷移、分泌細(xì)胞外基質(zhì),并促進(jìn)其由未分化表型向分化表型轉(zhuǎn)化,其作用與其分子中糖基化結(jié)構(gòu)無關(guān),糖基化可以增強(qiáng)CREG的生物學(xué)功能,wtCREG蛋白在M6P/IGF2R作用位點(diǎn)主要是7～10號和11～15號結(jié)構(gòu)域,而mCREG蛋白在M6P/IGF2R作用位點(diǎn)主要是11～15號結(jié)構(gòu)域。