E1A激活基因阻遏子調(diào)控體外培養(yǎng)人血管平滑肌細胞表型轉(zhuǎn)化.pdf

1、本研究初步探討CREG基因調(diào)控人VSMCs表型轉(zhuǎn)化的分子機制。 實驗方法： (1)以帶綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)的空載體pLNCX(+)/GFP為對照，用磷酸鈣共沉淀法將正義CREG逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體[pLNCX2(+)/CREG]、反義CREG逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體[pLXSN(-)/CREG]及pLNCX(+)/GFP感染293細胞，包裝出完整的逆轉(zhuǎn)錄病毒后，感染HITASY細

2、胞，經(jīng)G418篩選，獲得穩(wěn)定感染的細胞克隆。 (2)應用免疫熒光染色、Westernblot等方法檢測感染前后HITASY細胞中CREG蛋白和平滑肌分化標志蛋白SMα-actin的表達和定位。 (3)應用倒置相差顯微鏡觀察感染前后HITASY細胞的形態(tài)學改變。 (4)應用Westernblot法檢測感染前后CREG蛋白對SMα-actin相關(guān)調(diào)控因子-RhoA表達的調(diào)控。 (5)應用免疫熒光染色，總蛋白、

3、核蛋白及漿蛋白的Westernblot等方法檢測感染前后CREG蛋白對SMα-actin相關(guān)調(diào)控因子-SRF的表達和定位的調(diào)控。 (6)以Rho激酶特異性抑制劑Y-27632作用pLNCX2(+)/CREG細胞后，Westernblot法分析SMα-actin的表達及SRF的核轉(zhuǎn)位。 (7)應用免疫共沉淀分析感染前后細胞無血清培養(yǎng)基中CREG蛋白的分泌表達及CREG與6-磷酸甘露醇胰島素樣生長因子Ⅱ受體(insulin-

4、likegrowthfactorⅡ/mannose6-phosphatereceptor，M6P/IGF2R)的相互作用關(guān)系。 (8)以蛋白磷酸酶PP2A特異性抑制劑okadaicacid(OA)減少M6P/IGF2R在細胞膜表面分布后，應用Westernblot等方法檢測OA對CREG基因誘導的RhoA、SRF、SMα-actin蛋白表達的影響。 (9)以細胞計數(shù)法、BrdU摻入法及流式細胞分析方法檢測感染前后HITA

5、SY細胞的增殖能力。 (10)采用熒光顯微鏡下觀察DAPI染色后凋亡細胞核形態(tài)，AnnexinV/PI流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡率以及RT-PCR技術(shù)分析凋亡相關(guān)基因Caspase-9mRNA的表達，判定細胞的凋亡情況。 (11)Westernblot分析感染前后p38絲裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activatedproteinkinase，p38MAPK)和磷酸化p38MAPK(phosphorylated

6、p38MAPK，p-p38MAPK)的表達變化，并以SB203580阻斷p38MAPK信號通路后檢測細胞的凋亡情況。 實驗結(jié)果： (1)將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLNCX2(+)/CREG及pLXSN(-)/CREG用磷酸鈣共沉淀法分別感染HITASY細胞后，以正常HITASY細胞為空白對照，用免疫熒光染色和Westernblot法觀察與空白對照組相比感染前后的HITASY細胞中CREG蛋白的表達。結(jié)果表明感染pLNCX

7、2(+)/CREG的HITASY細胞CREG蛋白表達明顯上調(diào)；而感染pLXSN(-)/CREG的HITASY細胞其CREG蛋白表達下調(diào)。 (2)感染前后HITASY細胞的形態(tài)學和生長特性的改變。正常HITASY細胞呈典型的波峰波谷樣生長，去血清培養(yǎng)后細胞變細長呈長梭形；pLNCX2(+)/CREG穩(wěn)定感染的HITASY細胞體積變小且更加細長，易于環(huán)繞排列生長呈管腔樣結(jié)構(gòu)，細胞呈現(xiàn)典型的分化表型生長，去血清后細胞形態(tài)無明顯改變；p

8、LXSN(-)/CREG穩(wěn)定感染的細胞體積明顯增大，細胞失去極性呈無序樣生長，去血清培養(yǎng)后，細胞未呈現(xiàn)分化狀態(tài)，反而不耐受饑餓而出現(xiàn)大量死亡現(xiàn)象。 (3)感染前后CREG蛋白對SMα-actin及其相關(guān)調(diào)控因子-RhoA和SRF的表達和定位的調(diào)控。pLNCX2(+)/CREG穩(wěn)定感染細胞中SMα-actin表達顯著增加，同時SRF入核轉(zhuǎn)位，RhoA總蛋白表達上調(diào)，而pLXSN(-)/CREG穩(wěn)定感染的細胞SMα-actin蛋白表

9、達顯著降低，同時伴有SRF出核轉(zhuǎn)位及RhoA總蛋白表達下調(diào)。 (4)Y-27632對CREG蛋白介導的SRF入核轉(zhuǎn)位的影響。pLNCX2(+)/CREG穩(wěn)定感染的細胞以Rho激酶特異性抑制劑Y-27632作用后，CREG誘導的SMα-actin表達下調(diào)的同時SRF出核轉(zhuǎn)位。 (5)免疫共沉淀分析發(fā)現(xiàn)，CREG蛋白能被分泌到VSMCs培養(yǎng)基中表達，并可與細胞膜受體M6P/IGF2R發(fā)生直接相互作用。經(jīng)OA作用減少M6P/I

10、GF2R在細胞膜表面分布可明顯抑制CREG蛋白過表達引起的RhoA、SRF和SMα-actin表達。 (6)感染前后HITASY細胞增殖和凋亡能力的改變。CREG蛋白過表達明顯抑制HITASY細胞增殖，同時也抑制血清饑餓誘導的細胞凋亡的發(fā)生；而CREG表達抑制后HITASY細胞增殖能力和自然凋亡能力均顯著增加。 (7)p38MAPK信號通路對CREG蛋白調(diào)控VSMCs凋亡的影響。pLNCX2(+)/CREG穩(wěn)定感染的細胞

11、p38MAPK、p-p38MAPK的表達增加，而pLXSN(-)/CREG穩(wěn)定感染的細胞p38MAPK、p-p38MAPK表達顯著下降。SB203580阻斷p38MAPK信號傳導通路后，CREG過表達引起的細胞凋亡抑制作用被明顯減弱，血清饑餓后CREG過表達的HITASY細胞中細胞凋亡現(xiàn)象明顯增加。 研究結(jié)論：在體外培養(yǎng)的人VSMCs中，CREG可能作為一種分泌型蛋白質(zhì)通過與細胞膜受體M6P/IGF2R相互作用，依次激活SMα-