晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體信號通路對血管外膜成纖維細(xì)胞的功能影響.pdf

1、血管外膜通過直接或間接作用對血管的結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)起著重要的調(diào)控作用。血管外膜成纖維細(xì)胞(AF)是血管外膜的主要細(xì)胞成分，在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展、不良血管重塑和血管再狹窄起重要作用。晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)與AF參與糖尿病相關(guān)并發(fā)癥，組織AGEs濃度與動脈粥硬化斑塊的嚴(yán)重程度相關(guān)，AGEs的直接作用以及其與受體結(jié)合后的效應(yīng)，均可引起致動脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞以及多種因子的激活。糖尿病患者及老年人群血管外膜中AGEs逐漸堆積，對AF等外膜細(xì)

2、胞產(chǎn)生影響，但其內(nèi)部機(jī)制仍不甚了解，本研究從AGEs對AF細(xì)胞遷移、氧化應(yīng)激及相關(guān)炎癥反應(yīng)方面進(jìn)行探討。主要內(nèi)容分五部分： 第一部分晚期糖基化終產(chǎn)物對血管外膜成纖維細(xì)胞糖基化終產(chǎn)物受體表達(dá)的影響 目的：探討AGEs對AF晚期糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for AdvancedGlycation Endproducts，RAGE)表達(dá)的影響。 方法：用組織貼塊法培養(yǎng)SD大鼠的AF。熒光免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定細(xì)胞。

3、細(xì)胞同步化處理，分別加入不同濃度(50、100、150、200、300μg/ml)的晚期糖基化人血清白蛋白(Advanced Glycation Endproducts-Human Serum Albumin，AGE-HSA)干預(yù)24小時，以200μg/ml人血清白蛋白(Human Serum Albumin，HSA)作為對照。用RT-PCR和Western-blot技術(shù)檢測RAGE基因和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：50、100、150

4、、200、300μg/ml的AGE-HSA可分別上調(diào)RAGE mRNA和蛋白的表達(dá)，且RAGE表達(dá)150μg/ml、200μg/ml、300μg/ml組與對照組差異顯著(P＜0.05)，200μg/ml時達(dá)到峰值(P＜0.05)。該效應(yīng)可被p38拮抗劑、ERK1/2拮抗劑、JNK拮抗劑、坎地沙坦抑制。 結(jié)論：AGEs能夠上調(diào)AFs RAGE的表達(dá)，坎地沙坦能夠抑制該效應(yīng)。 第二部分晚期糖基化終產(chǎn)物促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞遷

5、移機(jī)制及坎地沙坦的干預(yù)作用研究 目的：觀察AGEs對AF遷移的影響，探討其機(jī)制及觀察坎地沙坦干預(yù)作用。 方法：用組織貼塊法培養(yǎng)SD大鼠的AF，用transwell小室檢測AGE-HSA對AF遷移的影響。用免疫印跡技術(shù)觀察AGE-HSA對AF絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路磷酸化影響。 結(jié)果： AGE-HSA可促進(jìn)p38、ERK1/2、JNK磷酸化，JNK在20min，p38、ERK1/2在30min達(dá)峰值(P＜

6、0.05)。p38拮抗劑、ERK1/2拮抗劑、JNK拮抗劑分別抑制p38、ERK1/2、JNK磷酸化，RAGE中和抗體、坎地沙坦可抑制p38、ERK1/2、JNK磷酸化。不同濃度AGE-HSA(50，100，150，200，300μg/ml)可促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞的遷移，200μg/ml時達(dá)到峰值(P＜0.05)。RAGE中和抗體、p38拮抗劑、ERK1/2拮抗劑、坎地沙坦均可抑制AGE所致成纖維細(xì)胞的遷移(P＜0.01)。結(jié)論：AG

7、Es經(jīng)由RAGE影響MAPK通路促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞遷移，坎地沙坦可通過阻斷此途徑抑制血管外膜成纖維細(xì)胞遷移，這可能是其血管保護(hù)作用的新機(jī)制。 第三部分晚期糖基化終產(chǎn)物對血管外膜成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激激活機(jī)制的研究 目的：觀察AGEs對AF氧化應(yīng)激的影響，探討其作用機(jī)制。 方法：用組織貼塊法培養(yǎng)SD大鼠的AF，用DCFH-DA檢測AGE-HSA對AFROS表達(dá)的影響。用RT-PCR、Western-blot檢測NA

8、DPH氧化酶亞基p22phox、p47phox表達(dá)。 結(jié)果： AGE-HSA可分別從基因和蛋白水平上調(diào)p22phox、p47phox的表達(dá)。氧化酶抑制劑DPI(diphenyliodonium)、APO(apocynin)、抗RAGE中和抗體、坎地沙坦可以抑制由AGE-HSA刺激引起的p22phox、p47phox表達(dá)上調(diào)(P＜0.05)。AGE-HSA可促進(jìn)ROS的表達(dá)上調(diào)。氧化酶抑制劑DPI、APO、抗RAGE中和抗體、坎地

9、沙坦可以抑制由AGE-HSA刺激引起ROS的表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：AGE-HSA經(jīng)由RAGE影響ROS與p22phox、p47phox的表達(dá)上調(diào)，ROS的上調(diào)與p22phox、p47phox表達(dá)相關(guān)。NADPH氧化酶抑制劑及坎地沙坦可通過下調(diào)p22phox、p47phox的表達(dá)減少AF內(nèi)ROS的產(chǎn)生。 第四部分晚期糖基化終產(chǎn)物促進(jìn)血管外膜成纖維細(xì)胞炎癥反應(yīng)機(jī)制及坎地沙坦干預(yù)研究 目的：觀察AGEs對AF炎癥反應(yīng)影響的

10、機(jī)制及坎地沙坦干預(yù)作用。 方法：用組織貼塊法培養(yǎng)SD大鼠的AF，RT-PCR檢測MCP-1、IL-6、VCAM-1mRNA表達(dá)，ELISA檢測培養(yǎng)液上清MCP-1、IL-6、VCAM-1。Western-blot及EMSA檢測NF-κB和I-κB-α。 結(jié)果：AGE-HSA200μg/ml作用AF后0.5h、1h、2h核內(nèi)NF-κB轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，作用后0.5h、1h I-κB-α磷酸化。AGE-HSA200μg/ml處理

11、促進(jìn)NF-κ B核內(nèi)移，加用坎地沙坦可抑制NF-κB核內(nèi)移，I-κB-α磷酸化也可被坎地沙坦抑制。不同濃度AGE-HSA(50、100、200、300μg/ml)均可使AF IL-6、VCAM-1、MCP-1 mRNA表達(dá)上調(diào)，50、100μg/ml與對照組比較mRNA表達(dá)量有顯著差異(P＜0.05)，200、300μg/ml與對照組比較mRNA表達(dá)量有顯著差異(P＜0.01)。用RAGE中和抗體、NF-κB抑制劑MG-132、坎地沙坦

12、預(yù)處理可減少由AGE-HSA所致IL-6、VCAM-1、MCP-1 mRNA表達(dá)及上清中蛋白的濃度(P＜0.05)。 結(jié)論：AGE-HSA通過RAGE、NF-κB途徑促使炎癥因子表達(dá)上調(diào)?？驳厣程箍捎行б种艻-κB-α磷酸化、NF-κB核內(nèi)移、炎癥因子表達(dá)，提示其具有糖尿病血管并發(fā)癥的治療作用。 第五部分血管外膜成纖維細(xì)胞的galectin-3表達(dá)及galectin-3基因的RNA干擾 目的：觀察AF半乳糖凝集素

13、-3(galectin-3)表達(dá)，構(gòu)建galectin-3 RNA干擾慢病毒載體，觀察AGEs受體galectin-3對血管成纖維細(xì)胞功能影響。 方法：RT-PCR檢測galectin-3表達(dá)，設(shè)計RNA干擾靶點序列，合成后galectin-3短發(fā)夾RNA克隆到慢病毒載體，限制性內(nèi)切酶分析和測序鑒定重組載體。工作載體和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，72小時后收集慢病毒，加入培養(yǎng)的血管成纖維細(xì)胞。Western blot檢測半乳糖凝