人CYP3A4與POR及cyt b5共表達條件的優(yōu)化以及表達產物在藥物相互作用研究中的應用.pdf

1、人細胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)是一大類含有血紅素分子的單加氧酶超家族，對外源及內源性的物質代謝以及環(huán)境致癌物的活化都起著至關重要的作用。細胞色素P450中主要負責藥物代謝的酶有3個家族：CYP1、CYP2和CYP3，包括了：CYP1A2、CYP2A6、CYP2A13、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4等。在人體內眾多的CYP450中，CYP3A4是人肝臟中含量最豐富，也是

2、與藥物代謝最為相關的一類酶。
　　 CYP3A4代謝了大約50％的臨床藥物，具有廣泛的代謝底物譜，并且底物結構和親和力具有多樣性。睪酮和咪達唑侖是CYP3A4活性鑒定的首選經典底物。CYP3A4催化的典型代謝途徑有C-氧化，如尼古丁(nicotine)；N-氧化，如伏立康唑(voriconazole)；N-脫烷基，如芬太尼(fentanyl)；O-脫烷基，如氟西汀(fluoxetine)；脫氫，如澳哌利多(bromperidol

3、)和氟哌啶醇(haloperidol)；硝基還原，如氯硝西泮(clonazepam)和C-羥化，如特非那定(terfenadine)(GuergerichFP et al.，1999)。
　　 人細胞色素P450氧化還原酶(cytochrome P4500xidoreductase，POR)是一個錨定在內質網(wǎng)膜上的重要黃素蛋白(Williams CH et al.，1962；Phillips AH et al.，1962；Pan

4、dey AV et al.，2010；Miller WL et al.，2011)，能通過其FMN與FAD輔基將NADPH上的電子傳遞給CYP450，以實現(xiàn)CYP450對底物的氧化功能(Porter TD etal.，1991；Pandey AV et al.，2010；Porter TD et al.，2011)。
　　 人細胞色素b5(Cytochrome bs，cyt bs)是細胞色素b家族一類膜錨定的蛋白。細胞色素bs攜

5、帶有兩個鐵血紅素基團，為其他膜錨定的加氧酶(如某些CYP450)傳遞電子。
　　 隨著分子生物學技術的發(fā)展，克隆和異源表達基因重組人蛋白酶被越來越廣泛的應用于科研當中。異源表達系統(tǒng)可以高效、大量地獲得較高活性的重組人藥物代謝酶，從而可以在體外對某一個單一的藥物代謝酶進行研究。在實際的研究過程中，人們嘗試比較了多種表達系統(tǒng)，其中桿狀昆蟲表達系統(tǒng)不僅表達量高，而且具有正確的糖基化、磷酸化和組織定位表達等優(yōu)點，且所表達的蛋白生物學特性

6、與天然蛋白相似，可以其建立高預測能力的代謝模型，對臨床用藥有很大指導意義。
　　 本實驗采用Bac-to-Bac()桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)，共表達了CYP3A4、POR和cyt bs，并對表達條件進行了優(yōu)化，獲得了活性較好的CYP3A4、POR和cyt bs共表達微粒體。此外，我們將得到的微粒體對不同底物的代謝動力學進行了研究，并進一步進行了藥物相互作用的研究。
　　 一.人CYP3A4、POR與cyt bs的構建及共

7、表達目前用來表達藥物代謝酶的表達系統(tǒng)有許多種，其中主要包括大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞和Bac-to-Bac()桿狀病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)。本實驗采用病毒昆蟲細胞表達系統(tǒng)來獲得重組CYP3A4、POR和cyt bs的共表達產物。
　　 本實驗通過自己設計引物，從實驗室已有的載體上PCR得到CYP3A4、POR和cyt bs的目的基因。然后，將這些目的基因分別進行雙酶切，酶切產物回收后與pFastBacTM1載體相連。連接產物轉化至

8、DH5α感受態(tài)細胞中，挑取單克隆進行PCR、雙酶切鑒定，并經測序確證后，分別將重組pFastBacTM1-CYP3A4、pFastBacTM1-POR和pFastBacTM1-cyt bs質粒轉化至MAX Efficiency DH10BacTMcompetent Escherichia coli中，在DH10Bac中發(fā)生轉座，分別獲得Bacmid-CYP3A4、Bacmid-POR和Bacmid-cyt b5重組粘粒。然后，分別用這些

9、粘粒轉染Sf9(Spodopterafrugiperda9)細胞，即可獲得第一代重組桿狀病毒P1，將P1經過擴增后依次得到P2、P3，一般P3即可用于蛋白的表達。
　　 將得到的v-CYP3A4、v-POR和v-cyt bs三種病毒分別按一定的比例(例如v-CYP3A4：v-POR：v-cyt bs=1:1:1)同時加入至一瓶Sf9細胞中，使其同時感染細胞發(fā)生共表達。同時，為了得到更高代謝活性的蛋白，我們又用新的載體pFastB

10、acTMDual構建了pFastBacTMDual-POR-CYP3A4重組質粒。用上述同樣的方法得到P3的v-POR-CYP3A4后，我們將該病毒與v-cyt bs按1:1的比例加入至Sf9細胞中進行CYP3A4、POR和cyt b5的共表達。
　　 為了進行蛋白的大量表達，提高目的蛋白的表達量，我們還對Sf9細胞的搖瓶培養(yǎng)條件進行了摸索。通過反復實踐，我們發(fā)現(xiàn)當恒溫搖床的溫度為27℃，轉速為90rpm，80-120ml每25

11、0ml搖瓶中加入細胞密度為5×105個/ml的細胞液，并加入0.1%的Pluronic()F-68，細胞培養(yǎng)72h時，最適合細胞的生長和目的蛋白的表達。
　　 二.CYP3A4對不同底物的代謝動力學研究CYP3A4是人藥物代謝酶中最重要的酶，主要存在于肝臟和小腸中。CYP3A4酶約占人肝臟CYP450總量的30～40%(Paine MJ et al.，2000)，代謝了約38類多于150種的臨床用藥(Miners JO et a

12、l.，1996)，包括抗生素、抗真菌藥、抗抑郁藥、抗組胺藥、鈣拮抗劑、鎮(zhèn)靜催眠藥及激素等(Crespi CL et al.，1997)。因此，針對CYP3A4單一酶的代謝研究在藥物代謝學以及臨床藥理學上都占據(jù)著重要的地位。
　　 本實驗通過Bac-to-Bac()表達系統(tǒng)獲得CYP3A4、POR和cyt b5共表達產物，制備成微粒體，然后利用這些微粒體分別對睪酮和咪達唑侖這兩種底物進行代謝，經過動力學曲線的擬合，分別得到兩條代謝

13、動力學曲線以及各代謝動力學參數(shù)。此外我們還對這兩種代謝底物及產物的方法學、孵育條件和高效液相色譜(HighPerformance Liquid Chromatography，HPLC)條件進行了考察。通過對各底物代謝動力學的分析，我們得到共表達微粒體對睪酮和咪達唑侖這兩種底物代謝時的動力學參數(shù)分別為：睪酮，Km、Vmax與CLint分別為119.6±13.79μmol/L、0.52±0.026μmol/min/g protein和4.3

14、4 mL/min/g protein；咪達唑侖，Km、Vmax與CLint分別為6.79±0.56μmol/L、0.11±0.0029μmol/min/g protein和15.56 mL/min/g protein。
　　 本文運用在Sf9中共表達CYP3A4、POR和cytb5得到的微粒體對睪酮和咪達唑侖這兩種底物的代謝動力學進行了研究，并分別對其方法學、孵育條件和HPLC條件進行了考察。
　　 三.CYP3A4在藥

15、物相互作用研究中的應用由于CYP3A4廣泛的代謝底物譜，許多藥物不良反應(Adverse Drug Reaction，ADR)是由CYP3A4代謝藥物之間的藥物相互作用(Drug-Drug Interaction，DDI)所引起的(Guengerich FP et al.，1997)。因此異源重組表達CYP3A4，并研究其底物之間的藥物相互作用可以為臨床上體內的藥物相互作用提供可靠的參考(Masimirembwa CM et al.，1

16、999)。
　　 本實驗將上述共表達得到的微粒體用于考察酮康唑對睪酮代謝的影響以及咪達唑侖與睪酮之間的相互影響。最終，我們得到：隨著濃度的增加，酮康唑對CYP3A4代謝睪酮生成6β-羥基睪酮的抑制作用逐漸增強，通過Dixon作圖法我們得到其抑制常數(shù)Ki值為0.0594±0.00586μM。在咪達唑侖對睪酮代謝影響的實驗中，當?shù)孜锊G酮的濃度低于Km時，咪達唑侖對CYP3A4代謝睪酮生成6β-羥基睪酮具有明顯的抑制作用，并且這種抑制

17、作用隨著底物濃度的降低而增強。而當?shù)孜锊G酮的濃度達到200μM時，只有較高濃度的咪達唑侖(大于40μM)才對睪酮的代謝具有抑制作用，較低濃度的咪達唑侖反而對睪酮的代謝具有促進作用。而在睪酮對咪達唑侖代謝影響的實驗中，睪酮對不同濃度咪達唑侖的代謝都有明顯的抑制作用，并且這種抑制作用隨著底物濃度的降低而增強。
　　 本課題得到的實驗結果提示，利用Bac-to-Bac()表達系統(tǒng)共表達得到的CYP3A4、POR和cyt b5微粒體具有