人源CYP450s高表達體系和核受體介導的人源CYP3A4及MDR1誘導作用研究體系的構建和應用.pdf

1、本論文應用分子生物學和細胞生物學技術，建立人源CYP450s同工酶高表達體系和核受體介導的CYP3A4和MDR1誘導作用研究體系。再利用同工酶高表達體系初步探討黃芩素和黃芩苷對CYP2E1重組酶的抑制作用；通過核受體介導的誘導體系探討綠原酸、人參皂苷Rf、黃芩苷和黃芩素對CYP3A4和。MDR1的誘導作用及其分子機制，不僅為體外藥物代謝的研究提供實用的實驗模型，也為上述藥物的臨床應用提供有參考價值的實驗依據(jù)。
　　 1.人源CY

2、P450s高表達體系的構建及應用
　　 1.1 CYP450氧化還原酶（Cytochrome P450 oxidoreductase，CYPOR）作為主要電子供體對CYP450同工酶活性的保持具有重要作用。本研究首先應用逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）擴增獲得CYPOR編碼序列基因片段，插入至pET-22b（+）原核表達載體后構建p

3、ET-22b（+）-CYPOR重組表達載體。重組質粒轉化大腸埃希菌BL21，IPTG誘導表達后，成功獲得CYPOR重組蛋白。經(jīng)測定，重組CYPOR蛋白酶活性為1309.64nmol/mg·min，可作為工具酶用于后續(xù)研究。
　　 1.2桿狀病毒.昆蟲細胞表達系統(tǒng)（Bac-to-Bac）具有安全性好、表達水平高，可進行翻譯后加工的特點，是一種非常理想的真核表達系統(tǒng)。本研究利用Bac-to-Bac系統(tǒng)建立了人源CYP450s高表達體

4、系，獲得了CYP2E1、CYP2D6和CYP3A4等3種重組同工酶。應用特異性底物測定表達產(chǎn)物酶活性，結果表明，CYP2E1重組酶活性最高；多種因素可對表達產(chǎn)物酶活性產(chǎn)生影響，條件優(yōu)化是獲得CYP2E1重組酶最佳表達量和最高酶活性的重要環(huán)節(jié)。具體而言，當MOI值為0.1時，CYP2E1重組酶活性最高，之后隨著MOI值的增大而逐漸減??；重組病毒感染細胞72h時獲得的CYP2E1酶活性顯著高于48h、96h和120h； CYPOR和細胞色素

5、b5（Cytochrome b5，CYb5）的濃度對重組酶活性也有很大影響，適量添加對酶的催化反應有利。CYP2D6和CYP3A4重組酶已經(jīng)進行了MOI值、病毒感染時間和CYPOR、CYb5濃度等條件的優(yōu)化，但更為適合的條件仍有待進一步探索。
　　 1.3應用已獲得較高酶活性的CYP2E1重組酶初步研究了黃芩苷和黃芩素對CYP450同工酶的抑制作用。結果表明，黃芩苷的IC50為5.702μM，而黃芩素的IC50>50μM。提示黃

6、芩苷對CYP2E1具有較強的抑制作用，而黃芩素的抑制作用較弱。
　　 2.核受體介導的人源CYP3A4及MDR1誘導作用研究體系的構建和應用
　　 2.1本研究首先應用RT-PCR方法獲得人源CYP3A4的啟動子/增強子和視黃醛X受體（retinoid X receptorα，RXRα）基因片段，分別插入至pGL4.10和pCDNA3.1（-）表達載體中成功構建pGL4.10-CYP3A4啟動子報告基因表達載體和pCDN

7、A3.1（-）-RXRα真核表達載體。
　　 2.2 mRNA水平測定是基因轉錄調控研究的重要方面。本研究應用real time PCR方法考察了黃芩苷、黃芩素、綠原酸和人參皂苷Rf對CYP3A4和MDR1 mRNA水平的影響。結果顯示，黃芩苷、黃芩素、綠原酸和人參皂苷Rf對CYP3A4和MDR1轉錄水平產(chǎn)生不同程度的誘導作用。黃芩素的誘導作用最強；綠原酸和人參皂苷Rf僅對CYP3A4有誘導作用；黃芩苷對兩者則皆無明顯影響。黃芩

8、素、綠原酸和人參皂苷Rf還對CYP3A4 mRNA水平的影響具有一定的濃度依賴性，其濃度分別為20、0.1和10μM時對CYP3A4的誘導作用最強，為陰性對照的3.4倍、2.5倍和2倍。外，黃芩素、綠原酸和人參皂苷Rf對CYP3A4的蛋白表達和酶活性水平亦表現(xiàn)出一定的誘導作用。
　　 2.3 PXR和CAR是調控CYP3A4和MDR1基因轉錄水平的主要核受體。本研究應用報告基因檢測和細胞轉染技術建立了核受體介導的人源CYP3A4

9、和MDR1誘導作用研究體系。并用PXR和CAR受體的典型配體-利福平和CITCO對該體系進行了證實。研究結果表明，利福平能夠顯著增強PXR受體介導的CYP3A4和MDR1基因轉錄；CITCO通過活化CAR受體途徑上調了CYP3A4和MDR1基因轉錄水平。提示該研究體系成功建立，可用于藥物對CYP3A4和MDR1誘導作用的研究。應用該體系，本研究考察了黃芩苷、黃芩素、綠原酸和人參皂苷Rf對CYP3A4和MDR1的誘導作用機制。結果顯示，黃

10、芩素可以顯著增強CAR和PXR受體介導的CYP3A4和MDR1基因轉錄水平；綠原酸和人參皂苷Rf能夠上調CAR受體介導的CYP3A4啟動子活性，而PXR受體則較少參與，二者對MDR1啟動子活性無明顯影響。
　　 2.4 CYP3A4基因啟動子反應元件-DR3和ER6以及MDR1基因啟動子反應元件-DR4（Ⅰ）均能被CAR-RXRα和PXR-RXRα二聚體識別并發(fā)揮基因表達調控作用。針對DR4（Ⅰ）、DR3和ER6進行的EMSA研

11、究可以更為深入的揭示誘導作用及其機制。研究顯示，黃芩素可以明顯增強CAR/RXRα二聚體與DR3、ER6/DR4（Ⅰ），PXR/RXRα二聚體與DR3的結合作用，而對DR4（Ⅰ）和ER6與PXR/RXRα二聚體的結合能力無顯著影響。
　　 2.5大部分常用藥物均經(jīng)CYP3A代謝，包括新型免疫抑制劑他克莫司在內的多種藥物亦是CYP3A和P-gp的共同底物；上述研究已經(jīng)證實，黃芩素對CYP3A和P-gp均有誘導作用，因此當黃芩素制劑

12、與上述藥物合用時應考慮到藥物間相互作用發(fā)生的可能性。本研究利用體內研究方法對此進行了探討，結果顯示，黃芩素多次給藥可降低他克莫司血藥濃度，其中峰濃度降低約57％，AUC減小約55％。
　　 綜上所述，本研究構建了人源CYP450s同工酶高表達體系和核受體介導的CYP3A4和MDR1誘導作用研究體系。利用同工酶高表達體系獲得的高活性重組CYP2E1同工酶研究證實，黃芩苷對CYP2E1具有一定的抑制作用，而黃芩素抑制作用較弱。本研究

13、還利用核受體介導的CYP3A4和MDR1誘導作用研究體系考察了黃芩素、綠原酸和人參皂苷Rf對CYP3A4和MDR1的誘導作用及其機制。結果表明，黃芩素可以顯著增強CAR和PXR受體介導的CYP3A4和MDR1基因轉錄水平；綠原酸和人參皂苷Rf能夠上調CAR受體介導的CYP3A4啟動子活性，而PXR受體則較少參與，二者對MDR1啟動子活性無明顯影響。人源化CYP450s同工酶高表達體系和核受體介導的人源CYP3A4和MDR1誘導作用研究體