人lrg在大腸桿菌中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的免疫血清制備和鑒定

1、<p>　　人lrg在大腸桿菌中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的免疫血清制備和鑒定</p><p>　　作者：杜可軍，柴玉波，常文輝，侯理朝，張曉楠，陳南春，林樹新，陳蘇民 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 免疫血清 </p><p>　　【Abstract】 AIM: To express human lrg in E.coli and to obtain a

2、n anti-Lrg immune serum. METHODS: lrg cDNA was cloned into pcTAT vector. The fusion proteins were expressed in E.coli and purified by Ni-NTA column and SDS-PAGE. Rabbits were immunized with preliminary purified Lrg pro

3、tein and reinforced three times. The antiserum was collected. RESULTS: Antiserum against Lrg was obtained in immunized rabbits and its titer was more than 1∶1000 proven by ELISA and Western Blot. The purified Lrg </

4、p><p>　　【Keywords】 lrg; affinity purification; immune sera </p><p>　　【摘要】 目的： 在大腸桿菌表達(dá)人lrg，制備鑒定人Lrg免疫血清. 方法： 構(gòu)建pcTATlrg重組表達(dá)質(zhì)粒，并在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)相應(yīng)的融合蛋白；對(duì)表達(dá)的融合蛋白采用鎳柱和SDSPAGE純化；以純化蛋白作為免疫抗原，對(duì)新西蘭白兔實(shí)施多次免疫（間隔時(shí)間

5、分別為1 mo, 3 wk, 2 wk）. 結(jié)果： 獲得兔抗人Lrg免疫血清. 經(jīng)過(guò)ELISA和Western Blot檢測(cè)，效價(jià)在1∶1000以上. 真核細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，6HisTATLrg蛋白具有良好的穿透性,可以在30 min內(nèi)從培養(yǎng)液進(jìn)入細(xì)胞質(zhì); 免疫組化實(shí)驗(yàn)表明Lrg是一種胞質(zhì)蛋白; 兔抗人Lrg免疫血清可有效應(yīng)用于細(xì)胞和組織的檢測(cè). 結(jié)論： 制備得到兔抗人Lrg免疫血清，為lrg的功能研究打下基礎(chǔ). </p>

6、<p>　　【關(guān)鍵詞】 人lrg基因；親和純化；免疫血清 </p><p><b>　　0引言 </b></p><p>　　人lrg基因是一種脂多糖應(yīng)答基因. 系采用基于PCR的改良消減雜交技術(shù)［1］，用脂多糖刺激人牙髓細(xì)胞, 克隆得到并登陸GenBank的新基因［2,3］, 具體功能還不清楚. 生物信息學(xué)分析表明，人lrg基因的開放讀框約558 bp

7、, 預(yù)計(jì)編碼的蛋白質(zhì)包含186個(gè)氨基酸；編碼的序列中包含2個(gè)相互重疊的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)和1個(gè)螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu)［3］, 而亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)是DNA結(jié)合蛋白的特征性結(jié)構(gòu). 因此，對(duì)人lrg基因的研究既有線索可尋,又可以采用一些較新的方法［4］,來(lái)加快研究進(jìn)度. 而深入研究Lrg在體內(nèi)組織細(xì)胞分布特點(diǎn)及其功能，需要高效價(jià)的Lrg抗體. 為此，我們?cè)诖竽c桿菌中融合表達(dá)了人Lrg蛋白, 并對(duì)6HisTATLrg初步純化. 用純化后的蛋白，免疫新西

8、蘭大白兔, 以獲得高效價(jià)的抗Lrg血清. </p><p><b>　　1材料和方法 </b></p><p><b>　　1.1材料 </b></p><p>　　重組質(zhì)粒pUC19lrg由本室構(gòu)建［3］; BL21(DE3) 菌種和 pcTAT載體由本室保存. DNA marker DL2000購(gòu)于TaKaLa 公司

9、. PCR引物由上海博雅公司合成. 成年雄性新西蘭大白兔1只(1.2 kg)由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供. HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology; DAB，NBT/BCIP 由Sigma公司提供. SABCFITC、免疫組化檢測(cè)試劑盒由武漢博士德公司提供. </p><p><b>　　1.2方法 </b></p><p&

10、gt;　　1.2.1人lrg的擴(kuò)增和克隆PCR反應(yīng)體系中上下游引物P1，P2各20 pmol, 上游引物P1為AAGGTACCATGAAACAGCAAGAAGTACAAC，含有KpnⅠ酶切位點(diǎn); 下游引物P2為AACTCGAGCACATCAAGGAACCATCGTC，含有XhoⅠ酶切位點(diǎn). 模板pUC19lrg 0.02 μg , 10×PCR buffer 5 μL, 10 mmol/L dNTP 1 μL， pfu pol

11、ymerase 34 nkat. PCR反應(yīng)參數(shù)為95℃ 變性15 s, 56℃ 退火40 s，72℃ 延伸40 s，共30個(gè)循環(huán). </p><p>　　1.2.2人lrg原核表達(dá)載體的構(gòu)建利用PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)上述PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化. 純化的擴(kuò)增產(chǎn)物用KpnⅠ, XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，pcTAT載體進(jìn)行同樣的雙酶切. 16℃連接目的基因與載體片段, 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞, 挑克隆, 提取質(zhì)粒, 進(jìn)行KpnⅠ和

12、XhoⅠ雙酶切鑒定. </p><p>　　1.2.3人Lrg融合蛋白的表達(dá)純化和免疫血清的制備pcTATlrg 轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞, 用200 mL LB(Amp+)培養(yǎng), 1 mmol IPTG 誘導(dǎo)4 h, 收集細(xì)菌. 120 g/L SDSPAGE分析. 用Ni柱對(duì)超聲裂解誘導(dǎo)細(xì)菌上清進(jìn)行純化, 120 g/L SDSPAGE分析. 并用SDSPAGE分離純化后的融合蛋白. 將切下的目

13、的蛋白條帶研碎,溶于生理鹽水. 采用背部皮下多點(diǎn)注射,免疫新西蘭大白兔(以下同), 1 mo后加強(qiáng)免疫. 3 wk重新加強(qiáng)免疫. 2 wk后再?gòu)?qiáng)化1次. 于第4次加強(qiáng)免疫后7 d取兔血清. </p><p>　　1.2.4ELISA 檢測(cè)免疫血清的效價(jià)［5］初步純化的6HisTATLrg蛋白包被ELISA板, 間接ELISA法檢測(cè)兔抗人Lrg免疫血清的效價(jià). 一抗為1∶1000兔抗人Lrg免疫血清(對(duì)照組使用未免

14、疫兔血清); 二抗為1∶2000 HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG ; TMB顯色，BioRad自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定. </p><p>　　1.2.5Western Blot 檢測(cè)免疫血清效價(jià)［6］初步純化的6HisTATLrg融合蛋白進(jìn)行SDSPAGE分離,電轉(zhuǎn)移法將相應(yīng)蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，用10 mL 50 g/L的脫脂奶粉封閉. 一抗為1∶1000兔抗人Lrg免疫血清(對(duì)照組使用未免疫兔血清)，二抗為1∶50

15、00堿性磷酸標(biāo)記的羊抗兔IgG, 顯色試劑為NBT/BCIP. </p><p>　　1.2.6SABCFITC染色檢測(cè)免疫血清的效果爬片培養(yǎng)牙乳頭細(xì)胞,將初步純化的6HisTATLrg融合蛋白加入到培養(yǎng)液中. 30 min后取出細(xì)胞爬片, PBS洗滌, 多聚甲醛固定、正常山羊血清封閉, 分別加入1∶1000兔抗人Lrg免疫血清(對(duì)照組使用未免疫兔血清)、1∶2000生物素化的羊抗兔IgG, 熒光素染料SABCF

16、ITC, 奧林巴斯熒光顯微鏡觀察. </p><p>　　1.2.7免疫組化檢測(cè)免疫血清的效果對(duì)人睪丸組織進(jìn)行常規(guī)石蠟切片,用免疫組化檢測(cè)試劑盒進(jìn)行染色. 一抗為稀釋度1∶1000的兔抗人Lrg免疫血清; 二抗為1∶3000稀釋的羊抗兔IgG. 未免疫兔血清作為陰性對(duì)照. DAB顯色,常規(guī)脫水,透明,中性樹脂封片. </p><p><b>　　2結(jié)果 </b>&

17、lt;/p><p>　　2.1人lrg的擴(kuò)增和克隆以pUC19lrg為模板，利用設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增lrg基因. 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,可見約1000 bp目的條帶（Fig 1），與預(yù)期大小相符. </p><p>　　2.2人lrg原核表達(dá)載體的構(gòu)建融合表達(dá)載體pcTATlrg進(jìn)行KpnⅠ和XhoⅠ酶切鑒定. 酶切產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,可見約1000 b

18、p的目的條帶（Fig 2），與預(yù)期大小相符. </p><p>　　2.3人Lrg融合蛋白的表達(dá)純化和免疫血清制備經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化pcTATlrg細(xì)菌表現(xiàn)目的蛋白Mr 為25×103,占菌體蛋白總量的42%（Fig 3）. 經(jīng)Ni柱純化上清蛋白后,該目的蛋白占菌體蛋白總量的46%（Fig 3）. 將Ni柱純化后的蛋白進(jìn)行SDSPAGE二次純化（Fig 4），切下相應(yīng)的目的蛋白條帶，生理鹽水溶解，免疫

19、新西蘭白兔. </p><p>　　2.4ELISA檢測(cè)免疫血清的效價(jià)酶標(biāo)儀測(cè)量A280 nm值(平均數(shù))為: 空白孔0.035, 1∶1000抗體孔0.177. 二者之比大于5，參考試劑盒規(guī)定，表明免疫新西蘭大白兔所產(chǎn)生的免疫血清效價(jià)在1∶1000以上. </p><p>　　2.5Westernblot 檢測(cè)免疫血清效價(jià)誘導(dǎo)后的細(xì)菌有預(yù)期大小 (Mr為25×103) 的特異

20、性條帶(Fig 5), 同時(shí)未免疫兔血清沒有表達(dá)相應(yīng)的蛋白條帶. </p><p>　　2.6SABCFITC染色檢測(cè)免疫血清效果與對(duì)照組(Fig 6A)相比，加入6HisTATLrg融合蛋白的牙乳頭細(xì)胞在胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)明顯的綠色熒光(Fig 6B) . 表明6HisTATLrg融合蛋白在30 min內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞，而本實(shí)驗(yàn)制備的免疫血清可有效應(yīng)用于真核細(xì)胞的檢測(cè). </p><p>　　2.7免

21、疫組化進(jìn)行免疫血清的檢測(cè)加未免疫兔血清的睪丸間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)呈藍(lán)色 (Fig 7A) ；加兔抗人Lrg免疫血清的睪丸間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色免疫反應(yīng)陽(yáng)性顆粒(Fig 7B). 說(shuō)明Lrg蛋白位于正常睪丸組織睪丸間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi). </p><p><b>　　3討論 </b></p><p>　　近年來(lái)內(nèi)毒素血癥的研究在危重醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中十分活躍，對(duì)其發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)也在不斷深入

22、. 脂多糖（LPS）是一種內(nèi)毒素，大量實(shí)驗(yàn)表明，LPS、脂多糖結(jié)合蛋白(LBP)和脂多糖受體系統(tǒng)(CD14)參與了炎癥反應(yīng)的病理生理過(guò)程［7］. LPS在細(xì)胞表面以LPSLBPCD14三體復(fù)合物的形式活化TLR4信號(hào)傳導(dǎo)途徑，通過(guò)一系列胞內(nèi)分子的相互作用，產(chǎn)生炎性因子（如IL1，TNF等），導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，甚至出現(xiàn)DIC和MOD［8］. LPS是機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要觸發(fā)劑， 因此，探討LPS刺激后應(yīng)答基因的功能，尤其是新發(fā)現(xiàn)基因的功能，研究

23、其在LPS信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的作用部位和作用性質(zhì)，有助于闡明炎癥發(fā)生的分子機(jī)制. </p><p>　　我們課題組自從成功克隆lrg基因并登錄GenBank［1,3］以來(lái)，對(duì)該基因的功能展開了初步研究. 生物信息學(xué)分析表明，lrg基因編碼的蛋白可能是一種DNA結(jié)合蛋白. 本課題組的前期實(shí)驗(yàn)表明，lrg基因作為一種LPS應(yīng)答基因，會(huì)對(duì)真核細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生一定影響（資料待發(fā)表）. 盡管實(shí)驗(yàn)取得了一定進(jìn)展，但該基因更多功

24、能尚有待闡明. 利用課題組設(shè)計(jì)的引物，PCR得到了長(zhǎng)1000 bp的產(chǎn)物，與預(yù)期大小相符. 該片段不僅包括了lrg基因的編碼區(qū)，也包括了lrg基因下游的非編碼區(qū)序列. 為了進(jìn)一步研究lrg基因的功能，需獲得針對(duì)Lrg蛋白的特異性抗體，本室采用初步純化后的6HisTATLrg融合蛋白免疫新西蘭大白兔，獲得了兔抗人免疫血清. ELISA和Western Blot檢測(cè)表明，其效價(jià)在1∶1000以上; 并且具有比較高的特異性. </p

25、><p>　　我們采用的原核表達(dá)載體是pcTAT. 該載體采用T7啟動(dòng)子，帶有6His的純化標(biāo)簽以及HIVTAT部分基因序列. HIVTAT的部分基因序列編碼11個(gè)氨基酸，可以快速穿過(guò)所有哺乳動(dòng)物的細(xì)胞膜［9-11］；6His基因編碼6個(gè)氨基酸. 本實(shí)驗(yàn)成功地將Lrg蛋白與6His純化標(biāo)簽以及HIVTAT蛋白的基因進(jìn)行了重組，獲得了6HisTATLrg融合蛋白的基因. 重組基因編碼的融合蛋白含216個(gè)氨基酸. 預(yù)計(jì)該

26、蛋白Mr 為（20～26）×103. SDSPAGE表明，本研究表達(dá)的融合蛋白與預(yù)期大小相符. 通過(guò)蛋白融合，6HisTATLrg同樣獲得了快速穿膜特性，可在30 min內(nèi)迅速?gòu)呐囵B(yǎng)液穿過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)牙乳頭細(xì)胞的胞質(zhì). 這種快速穿膜特性對(duì)于研究該基因在真核細(xì)胞內(nèi)的功能具有非常重要的意義. 我們采用NiNTA純化系統(tǒng)［12］，專門用于純化含有6His標(biāo)簽的重組蛋白，具有較高的純化效率，初步純化了Lrg蛋白. 初步實(shí)驗(yàn)表明，我們獲得

27、的純化蛋白和免疫血清,純度和產(chǎn)量足以應(yīng)用于lrg的組織分布和功能研究. SABCFITC實(shí)驗(yàn)表明，在牙乳頭細(xì)胞中，加入的Lrg蛋白在胞質(zhì)中均勻分布. 而上述結(jié)果與</p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　?。?］ Chai YB, Zhao ZL. Improved PCRbased subtractive hybridization

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