缺氧通過MAP4和Op18調控細胞微管結構的作用及其機制研究.pdf

1、目的：
　　 心肌缺氧損傷廣泛存在于嚴重燒(創(chuàng))傷、心血管疾病等多種疾病病程中。嚴重燒傷后在有效循環(huán)血量顯著減少之前,即可發(fā)生心肌損害和功能減退,其機制尚不清楚。缺氧后細胞骨架的改變及其調節(jié)機制是近年來本領域的研究熱點。微管是細胞骨架的重要組成部分,本研究旨在明確缺氧早期心肌細胞微管的改變,并探討其原因和調控機制。
　　 材料和方法
　　 1、體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細胞,以HeLa細胞為對照,分為常氧、缺氧15

2、min、30min、60min組。觀察缺氧后微管和細胞活力的變化:α-微管蛋白免疫熒光染色,激光共聚焦顯微鏡觀察微管結構改變;提取聚合/游離態(tài)微管蛋白,wB半定量;CCK-8法檢測細胞活力。
　　 2、觀察缺氧后MAP4、Op18蛋白表達和活性(磷酸化)的變化。
　　 3、用不同的激酶抑制劑篩選缺氧時調節(jié)微管結構的激酶,檢測缺氧時該激酶活性的變化。
　　 4、通過抑制劑/重組腺病毒載體抑制/激活篩選出的激酶,觀察

3、MAP4、Op18磷酸化、微管結構和細胞活力的改變。
　　 5、免疫共沉淀和免疫熒光共定位檢測MAP4和篩選出的激酶間的相互作用。
　　 結果
　　 1、缺氧15min心肌細胞微管排列紊亂、部分斷裂;缺氧30min微管變稀疏、斷裂增加,聚合態(tài)微管蛋白減少;缺氧60min微管呈片段狀改變,聚合態(tài)微管蛋白進一步減少;與心肌細胞相比,HeLa細胞聚合態(tài)微管蛋白下降更快、幅度更大;兩種細胞活力均隨缺氧時間延長逐漸下降。<

4、br>　　 2、在心肌和HeLa細胞中,缺氧時MAP4(Ser768)磷酸化增加、活性降低,Op18(Ser16)磷酸化減少、活性升高。
　　 3、在p38/MAPK、PI3K/Akt和GSK-3β三種激酶中,只有p38/MAPK抑制劑可以使缺氧細胞微管結構好轉,PI3K/Akt和GSK-3β抑制劑使微管破壞加重;缺氧后15min,p38/MAPK激酶即已激活,缺氧30min時激酶活性進一步升高并持續(xù)到缺氧60 min;缺氧后

5、p38/MAPK激活與MAP4磷酸化的變化趨勢一致。
　　 4、在心肌和HeLa細胞中,p38/MAPK抑制劑SB203580(5μM)作用后,缺氧細胞MAP4(Ser768)磷酸化減少、活性增加,Op18(Ser16)磷酸化增加、活性降低,微管結構好轉,聚合態(tài)微管蛋白增加,細胞活力回升;MKK6(Glu)高表達使p38/MAPK持續(xù)激活后,MAP4(Ser768)磷酸化增加、活性降低,Op18(Ser16)磷酸化減少、活性增加

6、,微管解聚,聚合態(tài)微管蛋白降低,細胞活力下降。
　　 5、免疫共沉淀和免疫熒光共定位提示MAP4和p38/MAPK之間有相互作用,p38/MAPK可能是MAP4的上游激酶。
　　 結論
　　 缺氧激活p38/MAPK激酶,導致MAP4(Ser768)磷酸化增加、活性降低,Op18(Ser16)磷酸化減少、活性增加,二者協(xié)同作用引起微管解聚和結構破壞。抑制缺氧細胞p38/MAPK激酶可改善微管結構,提高細胞活力。這