FGFR1通過調(diào)控骨細胞功能影響骨穩(wěn)態(tài)的作用和機制研究.pdf

1、背景:
　　骨骼是人體最重要的力學支持器官，除對機體起支撐和保護作用外，骨骼在人體的代謝、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)及造血中發(fā)揮重要的作用。骨骼是機體礦物質代謝的重要參與者，通過控制鈣磷等無機物的儲存和釋放，可調(diào)節(jié)人體礦物質的平衡。骨骼還能作為內(nèi)分泌器官釋放多種因子，如骨鈣素(Osteocalcin，OCN)、成纖維細胞因子23(Fibroblast growthfactor23，F(xiàn)GF23)等，參與人體能量代謝、血糖、血磷平衡等重要生理過程。<

2、br>　　骨細胞是骨自身穩(wěn)態(tài)維持及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素，它能通過多種途徑維持其附近內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，還能對力學信號進行感知和傳導，并調(diào)控其周圍骨基質礦化。還可通過其樹突與骨表面的成骨細胞和破骨細胞建立聯(lián)系，調(diào)節(jié)其分化，影響骨重建。此外，骨細胞還具有內(nèi)分泌功能，調(diào)節(jié)礦物質代謝。FGFR1（Fibroblast growth factor receptor1，成纖維細胞生長因子Ⅰ型受體）是FGFRs家族的重要成員，在骨骼發(fā)育中發(fā)揮重要作用。其突變

3、可引起多種骨骼遺傳性疾病。FGFR1在骨膜、間充質細胞和各階段成骨細胞中表達。FGFR1對成骨細胞不同時期作用有差別，在骨骼發(fā)育早期抑制其前體細胞增殖，促進向其分化，晚期抑制其礦化。骨細胞是成骨細胞的終末分化狀態(tài)，亦可能受FGFR1調(diào)控。有研究表明FGFR1參與調(diào)控骨細胞功能。
　　Wnt/β-catenin信號是調(diào)節(jié)骨細胞功能的關鍵環(huán)節(jié)。不僅能改變骨密度、調(diào)節(jié)骨細胞釋放重要因子，還能調(diào)控其力學信號傳導、保持細胞活性。FGF與Wn

4、t信號間存在相互影響與串話。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)FGFR2和FGFR3均可調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin報道基因活性。因此，我們推測FGFR1也能通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控骨細胞功能。
　　目的:
　　明確FGFR1對骨細胞的調(diào)控作用。從全新的角度認識FGFRs調(diào)控骨代謝及機體穩(wěn)態(tài)的機制，也為從干預FGF/FGFR信號角度調(diào)控機體穩(wěn)態(tài)提供新的思路。
　　方法:
　　1.獲取、繁殖和鑒定FGFR1在骨

5、細胞特異敲除的小鼠（Fgfr1DMP1-CKO，突變小鼠）;
　　2.骨細胞特異敲除FGFR1對骨發(fā)育的影響;
　　2.1對胚胎15.5天胎鼠全骨架茜素紅/可爾辛藍染色，對比野生和突變小鼠在胚胎期的骨發(fā)育情況;
　　2.22月齡和6月齡小鼠身長、體重測量，比較其發(fā)育有無差異;
　　2.3 X線掃描對比觀察兩組小鼠體型和骨量;
　　2.4 MicroCT掃描野生型和突變型小鼠股骨，對比觀察骨小梁及骨皮質變化;

6、
　　2.5對小鼠脛骨切片Von kossa染色后觀察骨骼礦化情況，并進行骨骼形態(tài)學計量;
　　3.骨細胞特異敲除FGFR1對機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響;
　　3.1檢測兩組小鼠2月和6月時血糖及血清鈣磷水平;
　　4.骨細胞特異敲除FGFR1對骨重建的影響;
　　4.1對2月齡和6月齡小鼠骨組織切片、染色，觀察其形態(tài);
　　4.2鈣黃綠素雙標實驗對比觀察兩組小鼠骨形成速率;
　　4.3甲苯胺藍染色形

7、態(tài)計量單位骨表面成骨細胞;
　　4.4通過TRAP染色觀察骨小梁表面的破骨細胞，并計量單位骨表面上的數(shù)量及相對表面積;
　　5.骨細胞特異敲除FGFR1對骨細胞形態(tài)和功能的影響;
　　5.1 HE染色觀察骨細胞和骨陷窩形態(tài);
　　5.2掃描電鏡觀察骨細胞及骨陷窩形態(tài)變化;
　　5.3提取股骨干總RNA，對比兩組間相關基因表達變化;
　　5.4分離培養(yǎng)原代骨細胞，觀察FGFR1敲除的骨細胞形態(tài)是否有變化

8、;
　　5.5提取原代骨細胞RNA，對比觀察相關基因表達變化;
　　6.骨細胞凋亡的相關實驗;
　　6.1計數(shù)6月齡小鼠骨皮質骨細胞空陷窩比例;
　　6.2透射電鏡觀察6月齡骨皮質骨細胞;
　　6.3 TUNEL法檢測6月齡骨細胞凋亡情況;
　　6.4提取股骨干總RNA，檢測凋亡相關基因表達;
　　結果:
　　1.骨細胞中特異敲除FGFR1不影響胚胎期骨發(fā)育;
　　胚胎15.5天胎鼠

9、全骨架染色發(fā)現(xiàn)，兩組胎鼠體型無明顯差異，骨骼發(fā)育亦無顯著差別;
　　2.骨細胞特異敲除FGFR1對成年小鼠發(fā)育無顯著影響，骨量增多;
　　2.1對2月齡和6月齡小鼠進行對比觀察，發(fā)現(xiàn)野生小鼠和突變小鼠在這兩個時相點的身長、體重均無明顯差異;
　　2.2 X線掃描對比觀察兩組小鼠，發(fā)現(xiàn)體型無明顯差別。突變小鼠骨量較野生小鼠增加;
　　2.3 MicroCT掃描發(fā)現(xiàn)，突變小鼠BV/TV、Conn-Dens、Tb.N和

10、Tb.Th均顯著增高，SMI和Tb.Sp則明顯減低。;
　　2.4脛骨切片Von kossa染色形態(tài)學計量結果與上述一致，均提示突變小鼠骨量增加;
　　3.骨細胞特異敲除FGFR1后，成年的野生和突變小鼠血糖及鈣磷無顯著變化;
　　3.1骨細胞特異敲除FGFR1后，2月齡和6月齡突變小鼠血糖均有降低趨勢，但兩組間差異無統(tǒng)計學意義;
　　3.2骨細胞特異敲除FGFR1后，野生小鼠和突變小鼠的血清鈣磷水平在2月和6月

11、時相點均無顯著差異;
　　4.骨細胞特異敲除FGFR1后，骨量增多，骨形成增快;
　　4.1組織切片Von kossa染色觀察發(fā)現(xiàn)突變小鼠骨小梁數(shù)量明顯增加，形態(tài)無顯著異常，未見明顯礦化障礙;
　　4.2骨組織切片雙標檢測發(fā)現(xiàn)，突變組小鼠骨形成速率、礦化沉積率以及礦化表面積均顯著增加;
　　4.3骨組織切片甲苯胺藍染色形態(tài)學計量發(fā)現(xiàn)，突變小鼠單位骨表面成骨細胞數(shù)量顯著增加;
　　4.4骨組織切片TRAP染色

12、形態(tài)學計量發(fā)現(xiàn)，突變小鼠單位骨表面破骨細胞數(shù)量及破骨細胞相對面積均顯著減少;
　　5.骨細胞特異敲除FGFR1影響骨細胞形態(tài)和功能，骨陷窩形態(tài)亦發(fā)生變化;
　　5.1 HE染色切片發(fā)現(xiàn)6月齡突變小鼠骨皮質大量空陷窩;
　　5.2掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)6月齡突變小鼠大量骨細胞形態(tài)趨于橢圓或圓形;骨細胞陷窩形態(tài)隨之改變，并且有皺縮;
　　5.3提取股骨干組織總RNA，檢測相關基因表達，結果顯示突變組骨細胞標志性基因FGF2

13、3、SOST、DMP1表達均明顯減少。與WNT信號相關的β-Catenin、LEF-1、DVL表達顯著增高，AXIN2表達明顯減少。OPG/RANKL比例與破骨細胞分化和功能密切相關，我們在實驗中發(fā)現(xiàn)前者表達明顯增高，后者表達明顯減少，OPG/RANKL比例上調(diào)。
　　5.4分離兩組小鼠原代骨細胞，培養(yǎng)觀察未見其形態(tài)有顯著差異。
　　5.5突變小鼠原代骨細胞標志性基因FGF23、SOST表達明顯減少，DMP1表達明顯增加。與

14、WNT信號相關的β-Catenin、DVL表達明顯增高，LEF-1表達有增高趨勢，無統(tǒng)計學差異。與破骨細胞分化和功能相關的OPG表達明顯增高，RANKL表達明顯減少。
　　6.骨細胞特異敲除FGFR1引起骨細胞凋亡。
　　6.16月齡脛骨石蠟切片HE染色見突變小鼠骨皮質空骨陷窩明顯增多。
　　6.2透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)6月齡突變小鼠存在大量凋亡特征骨細胞，表現(xiàn)為細胞皺縮、核凝集、凋亡小體。
　　6.3 TUNEL免疫

15、熒光染色法顯示突變小鼠骨陷窩中凋亡陽性信號明顯增加。
　　6.4突變型骨細胞中與凋亡相關的基因Caspase3和Caspase8表達顯著升高。
　　結論:
　　1.骨細胞缺失FGFR1對胚胎期小鼠無顯著影響。
　　2.骨細胞特異敲除FGFR1引起FGF23表達減少，并未影響血清鈣磷水平。
　　3.骨細胞特異敲除FGFR1使成年期突變小鼠骨量增加，骨形成增快。
　　4.骨細胞特異敲除FGFR1促進成骨細