1、Survivin基因是由DC.Altirei克隆的抗凋亡基因，在細(xì)胞生存和細(xì)胞周期進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。Survivin主要功能包括抑制凋亡和調(diào)控細(xì)胞周期。Survivin屬于IAP家族，該家族還包括XIAP，cIAP1，cIAP2，NIAP，ML-IAP和apollon。IAP家族成員通過(guò)桿狀病毒IAP重復(fù)結(jié)構(gòu)域與caspase(pro-caspase-9，caspase-3 andcaspase-7)發(fā)生直接或間接作用來(lái)抑制凋亡。另
2、一方面，Survivin與內(nèi)著絲粒蛋白(inner centromere protein)，Aurora B激酶和Borealin一起組成染色體過(guò)客復(fù)合蛋白體，指導(dǎo)姐妹染色單體的精確分離，調(diào)控有絲分裂晚期微管的穩(wěn)定性，促進(jìn)細(xì)胞增殖。
在胚胎形成時(shí)期，Survivin大量表達(dá)，與正常的細(xì)胞分裂和組織分化相適應(yīng)。在終末分化的組織中，Survivin一般很難檢測(cè)到。但在腫瘤形成過(guò)程中，Survivin異常高表達(dá)。在多種人類腫瘤中
3、，Survivin的表達(dá)量與腫瘤不良預(yù)后及高復(fù)發(fā)率呈正相關(guān)相關(guān)。目前認(rèn)為，Survivin過(guò)度表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤對(duì)多種化療藥物產(chǎn)生耐受。此外，利用特異的反義寡核苷酸靶向干擾Survivin的表達(dá)能夠有效殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，Survivin作為腫瘤治療中最具腫瘤特異性的靶點(diǎn)之一受到科學(xué)家的密切關(guān)注?？茖W(xué)家們運(yùn)用不同策略靶向干擾Survivin的表達(dá)或其功能，曾嘗試運(yùn)用結(jié)合Survivin的啟動(dòng)子(如小分子化合物YM155)，抑制mRNA穩(wěn)定性
4、(如反義寡核苷酸和siRNA)，或干擾其功能(如Survivin顯性負(fù)突變株)以達(dá)到殺傷腫瘤的效果。
Op18(癌蛋白18)，也稱Stathmin，是普遍表達(dá)于真核細(xì)胞的一種微管調(diào)節(jié)蛋白，其表達(dá)水平在不同組織細(xì)胞中差異較大。最初，Op18作為一種微管失穩(wěn)蛋白被鑒定出來(lái)，它能精確地調(diào)節(jié)有絲分裂紡錘體的結(jié)構(gòu)和功能，且在多種惡性腫瘤細(xì)胞高度表達(dá)，如白血病，乳腺癌和卵巢癌等。這些都提示我們Op18在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，
5、是一個(gè)有潛在價(jià)值的腫瘤標(biāo)志，可作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。但迄今為止，Op18的化學(xué)抑制劑尚未有報(bào)道。
為了篩選新型的Survivin抑制劑，我們建立了一個(gè)小規(guī)模的化合物庫(kù)并發(fā)現(xiàn)小分子化合物GDP366能同時(shí)抑制Survivin和Op18/stathmin的表達(dá)。本課題通過(guò)觀察小分子化合物GDP366對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，對(duì)其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制進(jìn)行了探索，并以此為契機(jī)，進(jìn)一步探討了Survivin和Op18這兩個(gè)蛋白分子在調(diào)
6、控細(xì)胞分裂中的作用，為腫瘤靶向治療提供了新的思路，同時(shí)也為該化合物作為一種新型的化療藥物進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)奠定了理論基礎(chǔ)。
主要研究方法和結(jié)果：
1. GDP366選擇性抑制Survivin和Op18/stathmin的表達(dá)。HCT116細(xì)胞用GDP366以遞增的濃度處理48小時(shí)或一固定濃度(2.0μM)處理不同的時(shí)間，Western blotting分析表明Survivin和Op18表達(dá)減少，并呈劑量和時(shí)間依賴關(guān)
7、系。半定量RT-PCR的結(jié)果證實(shí)Survivin和Op18的mRNA水平受到明顯抑制。
2.GDP366抑制Survivin和Op18/stathmin的表達(dá)不依賴于p53和p21的水平。用GDP366處理48小時(shí)后，將HCT116 p53-/-細(xì)胞，HCT116 p21+/+細(xì)胞和HCT116p21-/-細(xì)胞進(jìn)行Western blotting分析。結(jié)果證實(shí)，在HCT116 p53-/-細(xì)胞和HCT116p21-/-細(xì)胞
8、中GDP366仍以劑量依賴的關(guān)系降低Survivin和Op18的表達(dá)，表明了GDP366對(duì)Survivin和Op18的抑制作用不依賴于p53和p21的狀態(tài)。
3.GDP366在體外抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤細(xì)胞克隆形成。HCT116細(xì)胞用GDP366處理48小時(shí)，改用新的無(wú)藥物培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)10天后，檢測(cè)細(xì)胞克隆形成數(shù)目。結(jié)果表明，GDP366以劑量依賴關(guān)系抑制HCT116細(xì)胞克隆形成數(shù)，其IC50大約是1.0μM.。p53或
9、p21缺失及野生型的HCT116細(xì)胞用GDP366處理72小時(shí)后，用羅丹明B檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果顯示，各種細(xì)胞均呈現(xiàn)劑量依賴的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)，其IC50分布在1.0-2.0μM的水平。這些結(jié)果表明p53和p21表達(dá)與否，GDP366都能抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。
4.GDP366抑制荷瘤裸鼠模型的腫瘤生長(zhǎng)。我們采用裸鼠接種腫瘤模型進(jìn)一步檢測(cè)了GDP366對(duì)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明GDP366在不引起小鼠發(fā)病或死亡的劑量下可有效抑
10、制皮下接種HCT116腫瘤的生長(zhǎng)(P＜0.05)，腫瘤體積及重量明顯減小。
5.GDP366誘導(dǎo)腫瘤多核細(xì)胞形成及中心體擴(kuò)增，微核形成，且誘導(dǎo)多倍體產(chǎn)生而不依賴于p53和p21水平。細(xì)胞免疫熒光，共聚焦及電鏡的結(jié)果均表明GDP366可誘導(dǎo)細(xì)胞體積變大，多個(gè)核的形成，中心體的擴(kuò)增及微核的產(chǎn)生。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期表明GDP366可誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期延長(zhǎng)及之后多倍體的產(chǎn)生，該現(xiàn)象可以持續(xù)72-96小時(shí)。將HCT116 p53
11、+/+和HCT116p53-/-細(xì)胞，HCT116p21+/+和HCT116p21-/-細(xì)胞對(duì)GDP366的反應(yīng)進(jìn)行比較，證實(shí)了GDP366誘導(dǎo)多倍體的產(chǎn)生不依賴于p53和p21的狀態(tài)。
6.GDP366誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞染色體不穩(wěn)定性。HCT116細(xì)胞用2.0μM的GDP366處理不同時(shí)間后將其染色體提取并檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)染色體異常(包括染色體中斷和缺口)的細(xì)胞比例呈現(xiàn)時(shí)間依賴關(guān)系的增高。Western blotting結(jié)果顯示GD
12、P366呈劑量-時(shí)間關(guān)系誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞產(chǎn)生γH2AX，并誘導(dǎo)Chk1Ser317和Chk2 Thr68位點(diǎn)磷酸化水平的增高。
7.GDP366通過(guò)抑制端粒酶活性誘導(dǎo)細(xì)胞衰老。HCT116細(xì)胞經(jīng)GDP366處理48-72小時(shí)后，可觀察到表達(dá)胞漿衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的衰老樣表型細(xì)胞增加。此外，TRAP檢測(cè)法發(fā)現(xiàn)，GDP366明顯抑制了端粒酶活性。
8.GDP366抑制微管蛋白聚合及腫瘤
13、細(xì)胞的遷移能力。對(duì)分別經(jīng)GDP366，紫杉醇和長(zhǎng)春新堿處理的HCT116細(xì)胞提取微管蛋白單體及二聚體的成分進(jìn)行Western blotting分析。對(duì)照組細(xì)胞，解聚與聚合的微管蛋白的比例大約為1∶1，長(zhǎng)春新堿處理的細(xì)胞組(陰性對(duì)照)比例大于1。相反，紫杉醇處理的細(xì)胞組(陽(yáng)性對(duì)照)比例明顯降低。GDP366處理后的細(xì)胞，這個(gè)比例也明顯降低，表明了GDP366可顯著抑制微管蛋白的解聚。用劃痕實(shí)驗(yàn)初步證明GDP366處理24小時(shí)后能抑制腫瘤細(xì)
14、胞的遷移。
結(jié)論及研究意義：
該研究中，我們鑒定出小分子化合物GDP366，它能有效并選擇性抑制Survivin和Op18的表達(dá)，這種抑制作用表現(xiàn)在蛋白和轉(zhuǎn)錄水平。盡管GDP366可引起p53和p21水平顯著增高，但對(duì)Survivin和Op18抑制作用并不依賴于p53和p21的狀態(tài)。相應(yīng)地，GDP366抑制微管蛋白的聚合，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞多倍體的形成，同樣不依賴于p53和p21的水平。GDP366在體內(nèi)和體外
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