缺氧微環(huán)境下微管相關(guān)蛋白4對人表皮細(xì)胞遷移能力影響及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　目前,在整個燒創(chuàng)傷領(lǐng)域,創(chuàng)面愈合是我們在燒創(chuàng)傷治療中遇到的基本問題,而如何來促進(jìn)皮膚燒創(chuàng)傷后創(chuàng)面的修復(fù)是燒創(chuàng)傷治療的主要任務(wù)。燒創(chuàng)傷后的創(chuàng)面愈合是個非常復(fù)雜的過程[1],它包含了各種細(xì)胞、各種因子以及在這些細(xì)胞和因子之間的錯綜復(fù)雜的關(guān)系[2],涉及到了細(xì)胞運(yùn)動、細(xì)胞黏附、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等細(xì)胞生物學(xué)的多個方面,但在這些過程中主要包括兩個方面的內(nèi)容:肉芽組織的形成以及創(chuàng)面再上皮化,在創(chuàng)面再上皮化這個過程中,表

2、皮細(xì)胞的遷移又被認(rèn)為是決定創(chuàng)面愈合的一個關(guān)鍵步驟,這也是目前國內(nèi)以及世界上創(chuàng)面愈合研究的焦點(diǎn)。目前的研究認(rèn)為,人皮膚在急性損傷后,如各種燒創(chuàng)傷會使創(chuàng)面處于一個暫時的缺氧狀態(tài),這個缺氧微環(huán)境可以促進(jìn)人表皮細(xì)胞的遷移,來完成我們皮膚的創(chuàng)面愈合,在體外實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)了缺氧微環(huán)境下表皮細(xì)胞的遷移能力會增強(qiáng)[3],但其具體機(jī)制目前尚不明確。
　　表皮細(xì)胞的遷移過程是一個復(fù)雜的細(xì)胞學(xué)行為,涉及表皮細(xì)胞與細(xì)胞外各種基質(zhì)的相互作用,包括細(xì)胞骨架的重

3、組以及細(xì)胞的非對稱性分裂增殖(asymmetric divisions)等等[4],在細(xì)胞遷移的每一個步驟當(dāng)中,都包含著細(xì)胞骨架特別是微管蛋白動力學(xué)的變化[5],需要進(jìn)行一系列的生化級聯(lián)反應(yīng)對微管蛋白動力學(xué)來進(jìn)行調(diào)控,以便確保細(xì)胞在遷移速度和方向上的有效性及可控性。目前有研究已經(jīng)證實(shí)缺氧條件下可以調(diào)控微管動力學(xué)[6]。所以,本研究就模擬人皮膚燒創(chuàng)傷后的局部缺氧微環(huán)境下,來觀察微管相關(guān)蛋白4(microtuble-associate pr

4、otein4,MAP4)在人永生化表皮細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)中的表達(dá)變化和對細(xì)胞遷移能力的影響,并試圖研究其機(jī)制。
　　我們在前期研究基礎(chǔ)上,建立起了HaCaT細(xì)胞的缺氧模型,并采用體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Tanswell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、免疫共沉淀(immunoprecipitation,IP)、免疫熒光染色(immumofluorescence,IF)以及蛋白免疫印跡(western blot,WB)技術(shù)等實(shí)驗(yàn)方法來觀察HaCaT細(xì)胞在

5、缺氧處理后細(xì)胞骨架蛋白的變化情況,MAP4在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)變化及其對細(xì)胞遷移能力的影響,并研究MAP4與細(xì)胞動力蛋白輕鏈1(Tctex-1)的關(guān)系及它們對HaCaT細(xì)胞遷移能力的影響。
　　研究方法:
　　本研究共分為三部分:
　　第一部分:系統(tǒng)觀察缺氧微環(huán)境下HaCaT細(xì)胞遷移能力的變化及細(xì)胞微管動力學(xué)的動態(tài)變化
　　1.建立 HaCaT細(xì)胞缺氧模型和培養(yǎng)方法:采用混合缺氧氣體預(yù)充方式(1％O2,94%

6、N2,5%CO2),利用簡易輸液袋密封后用真空泵抽氣后灌注混合氣體來進(jìn)行細(xì)胞缺氧處理及細(xì)胞培養(yǎng),方法簡便可行,細(xì)胞培養(yǎng)良好,無明顯不適現(xiàn)象。
　　2.設(shè)置細(xì)胞缺氧處理時間:24h,采用兩種體外細(xì)胞遷移模型(細(xì)胞體外劃痕實(shí)驗(yàn)和Tanswell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn))來觀察缺氧微環(huán)境下HaCaT細(xì)胞遷移能力的變化。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),采用單因素方差分析,兩兩比較行t檢驗(yàn),以P<0.05為

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)上有差異,P>0.05為差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無意義。
　　3.設(shè)置3個不同的細(xì)胞缺氧時間點(diǎn):0.5h、1h及3h,采用IF實(shí)驗(yàn)通過觀察HaCaT細(xì)胞骨架蛋白的主要成分α-微管蛋白(α-tubulin)的變化來觀察細(xì)胞微管動力學(xué)的動態(tài)變化。
　　第二部分:缺氧微環(huán)境下 MAP4對微管動力學(xué)的調(diào)控及 HaCaT細(xì)胞遷移能力的影響
　　1.設(shè)置4個不同的細(xì)胞缺氧時間點(diǎn):0.5h、1h、3h及24h,采用WB實(shí)驗(yàn)觀察缺氧微環(huán)境

8、下MAP4及磷酸化MAP4(p-MAP4)在HaCaT細(xì)胞中的表達(dá)變化。
　　2.構(gòu)建MAP4的高、低表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞,通過篩選建立穩(wěn)定的MAP4高、低表達(dá)的HaCaT細(xì)胞模型,采用細(xì)胞體外劃痕實(shí)驗(yàn)、Tanswell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及IF實(shí)驗(yàn)來觀察缺氧微環(huán)境下該細(xì)胞模型遷移能力的變化以及細(xì)胞微管動力學(xué)的動態(tài)變化。細(xì)胞缺氧處理時間同上,實(shí)驗(yàn)分組為:正常HaCaT組、高表達(dá)MAP4組、低表達(dá)MAP4組。
　　第三部分:缺

9、氧微環(huán)境下 Tctex-1與 MAP4的作用關(guān)系及對 HaCaT細(xì)胞微管動力學(xué)的調(diào)控和細(xì)胞遷移能力的影響
　　1.設(shè)置4個不同的細(xì)胞缺氧時間點(diǎn):0.5h、1h、3h及24h,采用WB實(shí)驗(yàn)觀察缺氧微環(huán)境下正常HaCaT組和高、低表達(dá)MAP4組中MAP4、p-MAP4及Tctex-1的表達(dá)變化。
　　2.構(gòu)建Tctex-1的高、低表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞,通過篩選建立穩(wěn)定Tctex-1高、低表達(dá)的HaCaT細(xì)胞模型,采用WB

10、實(shí)驗(yàn)觀察缺氧微環(huán)境下Tctex-1高、低表達(dá)細(xì)胞模型中MAP4、p-MAP4及Tctex-1的表達(dá)變化,細(xì)胞缺氧時間點(diǎn)同上。
　　3.采用細(xì)胞體外劃痕實(shí)驗(yàn)、Tanswell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)及IF實(shí)驗(yàn)來觀察缺氧微環(huán)境下Tctex-1的高、低表達(dá)細(xì)胞遷移能力的變化以及細(xì)胞微管動力學(xué)的動態(tài)變化。細(xì)胞缺氧處理時間同上,實(shí)驗(yàn)分組為:正常HaCaT組、高表達(dá)Tctex-1組、低表達(dá)Tctex-1組。
　　研究結(jié)果:
　　1.成功建立了

11、HaCaT細(xì)胞缺氧模型和培養(yǎng)方法。
　　2.細(xì)胞體外劃痕實(shí)驗(yàn)和 Tanswell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:缺氧處理后,增強(qiáng)了HaCaT細(xì)胞的遷移能力(P<0.05)。
　　3. IF實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:早期缺氧處理后,HaCaT細(xì)胞的骨架蛋白α-tubulin開始解聚向胞體周緣聚集,細(xì)胞骨架變得疏松,細(xì)胞形態(tài)開始呈現(xiàn)多形性,細(xì)胞變得不穩(wěn)定。
　　4.缺氧處理后,WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:早期缺氧后(0.5h-1h),HaCaT細(xì)胞中MA

12、P4和p-MAP4的表達(dá)會有短暫性的提高,隨著缺氧時間的延長(3h-24h),MAP4和p-MAP4的表達(dá)會迅速降低(P<0.05)。
　　5.成功建立了MAP4高、低表達(dá)的HaCaT細(xì)胞模型,細(xì)胞體外劃痕實(shí)驗(yàn)和Tanswell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與正常HaCaT組相比,低表達(dá)MAP4組細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制,缺氧處理后(24h)亦無明顯提高。而高表達(dá) MAP4組細(xì)胞遷移能力在缺氧后增加明顯(P<0.05),高、低表達(dá)對照組無

13、明顯變化。IF實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常HaCaT組相比,缺氧后低表達(dá)MAP4組細(xì)胞形態(tài)皺縮,骨架蛋白α-tubulin解聚不明顯,無邊集化現(xiàn)象,細(xì)胞遷移傾向不明顯。高表達(dá)MAP4組細(xì)胞在缺氧時間延長后細(xì)胞骨架蛋白α-tubulin變化趨勢與正常HaCaT組相似。
　　6.缺氧處理后,與正常HaCaT組相比,高表達(dá)MAP4組細(xì)胞中MAP4和p-MAP4的表達(dá)明顯增加,變化趨勢相同,低表達(dá)MAP4組中MAP4和p-MAP4的表達(dá)明顯降低。

14、Tctex-1的表達(dá)在早期缺氧后會短暫降低(0.5h),隨著缺氧時間延長表達(dá)增加(P<0.05),呈現(xiàn)遞增趨勢,且高表達(dá) MAP4組會增加 Tctex-1的表達(dá),相應(yīng)的低表達(dá)MAP4組會降低Tctex-1的表達(dá)的表達(dá)。
　　7.成功建立了Tctex-1高、低表達(dá)的HaCaT細(xì)胞模型。兩種細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與正常 HaCaT組相比,低表達(dá)Tctex-1組細(xì)胞遷移能力明顯受到抑制,而高表達(dá)Tctex-1組細(xì)胞遷移能力增加明顯(P<

15、0.05),高、低表達(dá)對照組無明顯變化。IF實(shí)驗(yàn)結(jié)果與高、低表達(dá)MAP4組細(xì)胞相似,高表達(dá)Tctex-1組細(xì)胞在缺氧后(24h)細(xì)胞骨架蛋白α-tubulin解聚明顯,出現(xiàn)邊集化現(xiàn)象,細(xì)胞骨架疏松,細(xì)胞呈現(xiàn)多形性,變得不穩(wěn)定而易于遷移。低表達(dá)Tctex-1組細(xì)胞皺縮,骨架蛋白解聚不明顯,無邊集化現(xiàn)象,缺氧后亦無明顯改變。
　　8.WB實(shí)驗(yàn)檢測到:缺氧處理后(時間點(diǎn)同上),高、低表達(dá)Tctex-1組中MAP4、p-MAP4和Tcte

16、x-1的表達(dá)變化趨勢同高、低表達(dá)MAP4組,且高表達(dá)Tctex-1組可以提高 MAP4的表達(dá),相應(yīng)的低表達(dá)Tctex-1組亦可以降低 MAP4的表達(dá)(P<0.05),現(xiàn)象同上。
　　結(jié)論:
　　缺氧微環(huán)境下可以調(diào)控HaCaT細(xì)胞中MAP4和Tctex-1的表達(dá)及細(xì)胞微管動力學(xué)的變化,使細(xì)胞的遷移能力得到增強(qiáng),其作用機(jī)制可能是缺氧微環(huán)境調(diào)控了MAP4的表達(dá)或者活性,進(jìn)而影響Tctex-1在HaCaT細(xì)胞的表達(dá)發(fā)生變化,共同來調(diào)