乳斑缺氧微環(huán)境調(diào)控胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞自我更新能力促進(jìn)腹膜轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究.pdf

1、前言：
　　腹膜轉(zhuǎn)移是胃癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移形式之一，是導(dǎo)致進(jìn)展期胃癌根治手術(shù)失敗的主要因素。腹膜乳斑為腹膜相關(guān)淋巴組織，是腹腔內(nèi)不成熟的巨噬細(xì)胞起源部位。在腹膜轉(zhuǎn)移過(guò)程中，腹腔游離癌細(xì)胞優(yōu)先定植在乳斑內(nèi)部，乳斑的獨(dú)特解剖結(jié)構(gòu)和血管分布為腫瘤細(xì)胞提供了提供了適宜的缺氧微環(huán)境。我們推測(cè)，在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移過(guò)程中，乳斑可以通過(guò)非特異性細(xì)胞毒作用部分清除成熟/衰老的胃癌細(xì)胞卻不能清除胃癌干/祖細(xì)胞;在乳斑缺氧微環(huán)境下，胃癌干/祖細(xì)胞維持了未分化表

2、型并且擁有很強(qiáng)的抗凋亡的能力，這亦有助于解釋胃癌干/祖細(xì)胞在傳統(tǒng)腹腔化療后可以生存并且迅速再生成腫瘤，進(jìn)而導(dǎo)致腹膜轉(zhuǎn)移。另一方面，乳斑中的巨噬細(xì)胞可被腫瘤細(xì)胞重塑，形成旁路激活表型的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，這亦有助于維持胃癌干/祖細(xì)胞的未分化表型。
　　目的：
　　確定腫瘤干細(xì)胞在轉(zhuǎn)移灶中所在位置并了解其調(diào)控機(jī)制是成功治療惡性腫瘤的一個(gè)重要的先決條件?，F(xiàn)已證實(shí)，缺氧微環(huán)境可以通過(guò)觸發(fā)胃癌干/祖細(xì)胞的適應(yīng)性轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，調(diào)節(jié)腫瘤干細(xì)胞的

3、分化和自我更新能力，并最終促使其向具有更強(qiáng)侵襲能力腫瘤表型發(fā)展。然而，我們?nèi)匀恍枰苯拥淖C據(jù)來(lái)證明胃癌干/祖細(xì)胞優(yōu)先定植在缺氧的乳斑中，同時(shí)缺氧微環(huán)境和HIF調(diào)控在維持胃癌干/祖細(xì)胞未分化表型過(guò)程中的作用機(jī)制亦需要進(jìn)一步闡明。本實(shí)驗(yàn)以腹膜乳斑是胃癌細(xì)胞入侵腹膜的門(mén)戶這一臨床現(xiàn)象為切入點(diǎn)，以乳斑缺氧微環(huán)境對(duì)胃癌干/祖細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控為核心研究?jī)?nèi)容，以新的視角解釋胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的成因，以期能夠完善胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為有效防治胃癌腹膜

4、轉(zhuǎn)移提供新的思路與靶點(diǎn)，亦為腹腔其它臟器惡性腫瘤腹膜轉(zhuǎn)移的防治提供依據(jù)。
　　方法：
　　1、采用免疫組化法檢測(cè)HIF-1α、OCT4、Nestin在175例進(jìn)展期胃癌中的表達(dá)情況，利用卡方檢驗(yàn)分析HIF-1α的表達(dá)與胃癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系;采用K-M法及Logrank檢驗(yàn)分析HIF-1α的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系;利用Kendall及Spearman非參數(shù)檢驗(yàn)分析HIF-1α與OCT4和HIF-1α的表達(dá)水平的相關(guān)性。

5、r>　　2、在體外誘導(dǎo)7例從胃癌腹膜轉(zhuǎn)移灶中原代培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞株缺氧，利用Western Blot方法檢測(cè)缺氧對(duì)胃癌細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)的影響;利用Transwell方法檢驗(yàn)HIF-1α表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響;利用Western Blot方法檢測(cè)HIF-1α表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞EMT狀態(tài)的影響;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺氧對(duì)胃癌細(xì)胞表面干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響;利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)缺氧對(duì)胃癌細(xì)胞側(cè)群細(xì)胞亞群比率的影響。
　　3、分選出胃癌

6、細(xì)胞側(cè)群細(xì)胞亞群，利用克隆形成和腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)缺氧對(duì)胃癌細(xì)胞自我更新能力的影響;在第三代腫瘤球中利用免疫熒光共聚焦技術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物OCT4及Nestin的表達(dá);利用免疫熒光共聚焦技術(shù)檢測(cè)胃癌干/祖細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物Mucin5ac及Mucin6的表達(dá)。
　　4、在裸鼠腹膜轉(zhuǎn)移模型中，利用免疫熒光共聚焦技術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)胃癌干/祖細(xì)胞進(jìn)入乳斑的病理過(guò)程;利用免疫熒光共聚焦技術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)胃癌干/祖細(xì)胞與乳斑缺氧區(qū)域的位置關(guān)系;利用

7、免疫熒光共聚焦技術(shù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)胃癌干/祖細(xì)胞中OCT4及Nestin與乳斑缺氧區(qū)域的位置關(guān)系。
　　5、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，在正常裸鼠或乳斑巨噬細(xì)胞衰竭裸鼠中腹腔注射正常或干擾HIF-1α表達(dá)的胃癌細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)裸鼠腹腔成瘤率、成瘤個(gè)數(shù)、腹水形成率以及形成腹水量體內(nèi)考察破壞乳斑缺氧區(qū)域或者阻斷乳斑內(nèi)缺氧信號(hào)傳遞情況下，對(duì)腹膜轉(zhuǎn)移的阻遏作用。
　　6、建立持續(xù)性缺氧和間斷性缺氧兩組胃癌細(xì)胞體外缺氧模型，利用Western Blot方法檢測(cè)

8、不同缺氧模型對(duì)胃癌細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)的影響;利用Real-time方法檢測(cè)不同缺氧模型對(duì)胃癌細(xì)胞中缺氧相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　7、利用劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell等方法檢測(cè)不同缺氧模型對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲能力的影響;利用Western Blot、免疫熒光共聚焦方法檢測(cè)不同缺氧模型對(duì)胃癌細(xì)胞EMT狀態(tài)的影響。
　　8、分選出胃癌細(xì)胞側(cè)群細(xì)胞亞群，利用克隆形成和腫瘤球形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同缺氧模型對(duì)胃癌細(xì)胞自我更新能力的影響;在第三代

9、腫瘤球中利用免疫熒光共聚焦技術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物OCT4及Nestin的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1、胃癌患者HIF-1α的表達(dá)與干細(xì)胞標(biāo)志物、轉(zhuǎn)移方式及預(yù)后密切相關(guān)
　　(1)HIF-1α的表達(dá)情況與組織分型、Lauren分型及復(fù)發(fā)情況密切相關(guān)。在組織分型中，HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性病例中未分化胃癌占77％，高于陰性表達(dá)病例的59.6％(P＜0.05)。在Lauren分型中，HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性病例中彌散型胃癌居多占62

10、.3％，陰性表達(dá)的病例中腸型胃癌居多占53.5％(P＜0.05)。復(fù)發(fā)情況中，HIF-1α表達(dá)陽(yáng)性病例中腹膜轉(zhuǎn)移病例占34.4％，顯著高于表達(dá)陰性病例中復(fù)發(fā)的比率16.7％(P＜0.05)。
　　(2)OCT4表達(dá)陽(yáng)性116例(65.2％)，陰性62例(34.8％);NESTIN表達(dá)陽(yáng)性113例(63.5％)陰性65例(36.5％)。相關(guān)性分析顯示，在Kendall檢驗(yàn)中，HIF-1α表達(dá)情況與NESTIN表達(dá)情況呈顯著正相關(guān)，相

11、關(guān)系數(shù)為0.6(P＜0.05);與OCT3/4表達(dá)情況呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.44(P＜0.05)。在Spearman檢驗(yàn)中，HIF-1α表達(dá)情況與NESTIN表達(dá)情況呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.71(P＜0.05);與OCT4表達(dá)情況呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.52(P＜0.05)
　　(3)HIF-1α表達(dá)不同的病例行K-M生存分析，結(jié)果顯示HIF-1α陰性表達(dá)病例預(yù)后好于陽(yáng)性表達(dá)病例（圖5），Log-Rank檢驗(yàn)P＜0.05。<

12、br>　　2、缺氧通過(guò)上調(diào)HIF-1α表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞EMT并增加干細(xì)胞比率
　　(1)缺氧培養(yǎng)條件下，缺氧敏感的胃癌腹膜轉(zhuǎn)移株GC1和GC2明顯上調(diào)HIF-1α的表達(dá)。GC1和GC2轉(zhuǎn)染慢病毒載體的HIF-1αshRNA，生物學(xué)行為穩(wěn)定后缺氧培養(yǎng)24小時(shí)，GC1HIF-1α△和GC2HIF-1α△在缺氧條件下均未上調(diào)HIF-1α表達(dá)。
　　(2)GC1和GC2細(xì)胞在缺氧條件下遷移能力顯著強(qiáng)于常氧條件(2.8-and 2.4

13、-fold increases,respectively;both P＜0.05).相反，GC1HIF-1α△ and GC2HIF-1α△細(xì)胞在常氧及缺氧條件下的遷移能力無(wú)顯著變化。
　　(3)缺氧條件下GC1和GC2細(xì)胞下調(diào)上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad的表達(dá);上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物α-SMA，GC1和GC2細(xì)胞發(fā)生了顯著的EMT轉(zhuǎn)化。而在GC1HIF-1α△和GC2HIF-1α△細(xì)胞中，α-SMA和E-cad的表達(dá)無(wú)明顯變化。

14、　　(4)缺氧培養(yǎng)條件下，GC1和GC2細(xì)胞CD44及Lgr5的表達(dá)顯著高于常氧培養(yǎng)(8.7-and 5.1-fold increases for lgr5,both P＜0.05;1.7-and 7.1-fold increases for CD44，P=0.24 and P＜0.05，respectively).而在GC1HIF-1α△和GC2HIF-1α△細(xì)胞中，CD44或Lgr5的表達(dá)無(wú)明顯變化。
　　(5)在常氧條件下，

15、GC1和GC1HIF-1α△均富含verapamil敏感的側(cè)群細(xì)胞(6.4％ and 3.5％，respectively)。經(jīng)過(guò)七天的缺氧培養(yǎng)，GC1細(xì)胞的SP亞群顯著增加(for GC1,SP ratio was 6.4±0.54％ in normoxia and 22.46±3.57％ in hypoxia,P＜0.05)。而對(duì)于GC2和GC2HIF-1α△細(xì)胞，雖然表達(dá)高水平的干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和Lgr5，但是他們并不富含ver

16、apamil敏感的側(cè)群細(xì)胞(both＜0.5％，data not shown)。
　　3、缺氧增強(qiáng)胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞自我更新能力，抑制多向分化能力
　　(1)在缺氧條件下GC1sp細(xì)胞的克隆形成能力顯著增強(qiáng)(31±3.6vs.13.7±2.1，P＜0.05)。然而GC1HIF-1α△細(xì)胞的SP亞群在常氧或缺氧條件下克隆形成能力無(wú)明顯變化（5.3±0.5vs.5.1±2.1）。
　　(2)GC1細(xì)胞SP亞群可以在缺氧條件下

17、連續(xù)三代形成腫瘤球，并且腫瘤球形成率逐漸增加。GC1細(xì)胞SP亞群可以在常氧條件下腫瘤球形成能力并無(wú)明顯變化。GC1HIF-1α△細(xì)胞的SP亞群在常氧或缺氧條件下腫瘤球形成能力亦無(wú)明顯變化。
　　(3)缺氧培養(yǎng)的GC1細(xì)胞SP亞群第三代腫瘤球中，HIF-1α的表達(dá)顯著高于其他三組，各組腫瘤球中均存在HIF-1α高表達(dá)亞群，缺氧培養(yǎng)的GC1細(xì)胞的SP亞群第三代腫瘤球中該亞群細(xì)胞比率顯著高于其他各組。OCT3/4表達(dá)定位于細(xì)胞核，缺氧培

18、養(yǎng)的GC1細(xì)胞SP亞群第三代腫瘤球中其表達(dá)顯著高于其他三組，且與HIF-1α存在共定位關(guān)系;Nestin表達(dá)定位于細(xì)胞膜，缺氧培養(yǎng)的GC1細(xì)胞SP亞群第三代腫瘤球中其表達(dá)顯著高于其他三組，與HIF-1α存在共定位關(guān)系;GC1細(xì)胞的SP亞群第三代腫瘤球中，存在另外一群高表達(dá)OCT3/4但低表達(dá)HIF-1α的亞群，其他三組未發(fā)現(xiàn)該群細(xì)胞。
　　(4)缺氧培養(yǎng)的GC1細(xì)胞SP亞群第三代腫瘤球中，HIF-1α的表達(dá)顯著高于其他三組。Muc

19、in5ac及Mucin6表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，缺氧培養(yǎng)的GC1細(xì)胞的SP亞群第三代腫瘤球中的表達(dá)顯著低于其他三組，與HIF-1α不存在共定位關(guān)系，高表達(dá)HIF-1α的細(xì)胞不表達(dá)Mucin5ac及Mucin6，三組中均存在另外一群高表達(dá)Mucin5ac及Mucin6但低表達(dá)HIF-1α的亞群。
　　4、胃癌腹膜轉(zhuǎn)移過(guò)程中乳斑呈現(xiàn)缺氧微環(huán)境
　　(1)胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞進(jìn)入腹膜乳斑一周后，開(kāi)始克隆性增生，乳斑邊界模糊不清但尚可分辨;2

20、周后，胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞占據(jù)乳斑原有位置，進(jìn)入快速增值階段，周?chē)罅烤奘杉?xì)胞浸潤(rùn)，乳斑原有結(jié)構(gòu)遭到破壞;乳斑內(nèi)部胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的增殖速率遠(yuǎn)高于非乳斑區(qū)域的胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。
　　(2)缺氧區(qū)域主要集中在乳斑密集的部位，而且呈帶狀環(huán)形包繞著乳斑，胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞主要定植在乳斑帶狀缺氧區(qū)域的內(nèi)部及邊緣，與缺氧區(qū)域有較多重合;乳斑巨噬細(xì)胞則主要位于帶狀缺氧區(qū)域的邊緣，與缺氧區(qū)域重合不多。
　　(3)在缺氧區(qū)域中，胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞高

21、表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4和Nestin;在非缺氧區(qū)域，胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞幾乎不表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4和Nesfin。
　　5、破壞乳斑缺氧微環(huán)境可以抑制胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的腹膜轉(zhuǎn)移
　　(1)經(jīng)過(guò)9天（共三次）的clodronate liposomes作用后，裸鼠乳斑面積顯著減小，單個(gè)乳斑內(nèi)巨噬細(xì)胞數(shù)量亦顯著減少。
　　(2)正常裸鼠注射GC1細(xì)胞的SP亞群后腹膜轉(zhuǎn)移情況最嚴(yán)重;乳斑巨噬細(xì)胞耗竭裸鼠注射GC1HIF-1α

22、△細(xì)胞的SP亞群后腹膜轉(zhuǎn)移情況最輕微。注射GC1HIF-1α△細(xì)胞的SP亞群的乳斑巨噬細(xì)胞耗竭裸鼠比注射GC1細(xì)胞的SP亞群的乳斑巨噬細(xì)胞耗竭裸鼠腹膜轉(zhuǎn)移情況顯著減輕;注射GC1HIF-1α△細(xì)胞的SP亞群的正常竭裸鼠比注射GC1細(xì)胞的SP亞群的正常裸鼠腹膜轉(zhuǎn)移情況亦顯著減輕。
　　6、不同缺氧模型對(duì)SGC-7901細(xì)胞缺氧及缺氧相關(guān)蛋白/基因表達(dá)的影響
　　(1)缺氧48小時(shí)后，HIF-1α開(kāi)始表達(dá)于持續(xù)缺氧和間斷缺氧的S

23、GC-7901細(xì)胞，間斷缺氧的SGC-7901細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)高于持續(xù)缺氧的SGC-7901細(xì)胞;HIF-1α的表達(dá)在168小時(shí)后達(dá)到最大值。間斷缺氧的SGC-7901細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)多位于細(xì)胞核內(nèi)及核周;持續(xù)缺氧的SGC-7901細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)多位于胞漿。
　　(2)在兩組胃癌細(xì)胞缺氧模型中，缺氧相關(guān)基因HIF-1α、CA9、GLUT-1以及干細(xì)胞相關(guān)基因OCT4、Nanog的表達(dá)均顯著上調(diào)(allP＜0.0

24、5);HIF-1α、CA9、Nanog基因在持續(xù)缺氧和間斷性缺氧兩組模型之間的表達(dá)無(wú)顯著性差異(allP＞0.05);間斷性缺氧模型中GLUT-1、OCT4的表達(dá)顯著高于持續(xù)性缺氧模型(bothP＜0.05)。
　　7、不同缺氧模型對(duì)SGC-7901細(xì)胞遷移，侵襲能力的影響
　　(1)在兩組胃癌細(xì)胞缺氧模型中，SGC-7901細(xì)胞的遷移能力均顯著增強(qiáng)(1.7 and 1.9 times as large，respective

25、ly;both P＜0.05);兩組胃癌細(xì)胞缺氧模型間SGC-7901細(xì)胞的遷移能力相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)在兩組胃癌細(xì)胞缺氧模型中，SGC-7901細(xì)胞的遷移能力均顯著增強(qiáng)(2.0 and 3.3 folds，respectively，P＜0.05);間斷性缺氧的SGC-7901細(xì)胞侵襲能力強(qiáng)于持續(xù)性缺氧的SGC-7901細(xì)胞(1.6-fold increase，P＜0.05)。
　　(2)在兩組胃癌細(xì)胞缺氧模型中，SG

26、C-7901細(xì)胞上調(diào)上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物E-cadherin蛋白的表達(dá);下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-SMA蛋白的表達(dá)。在兩組胃癌細(xì)胞缺氧模型中，SGC-7901細(xì)胞上調(diào)上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá);下調(diào)間質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物α-SMA蛋白的表達(dá)。
　　8、不同缺氧模型對(duì)SGC-7901細(xì)胞干細(xì)胞特性的影響
　　(1)在兩組胃癌細(xì)胞缺氧模型中，缺氧胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的克隆形成能力均顯著增強(qiáng)(37±6.9 and

27、35±6.2 vs.13.7±2.7，respectively;both P＜0.05);間斷性缺氧模型中胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的侵襲能力顯著強(qiáng)于持續(xù)性缺氧中胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的侵襲能力(1.6-fold increase，P＜0.05)。缺氧SGC-7901的側(cè)群細(xì)胞亞群均顯著增加(20.8±2.2％ vs.14.7±1.5％ and 3.5±0.3％，respectively;both P＜0.05);間斷性缺氧模型中SGC-7901細(xì)胞側(cè)

28、群細(xì)胞亞群顯著高于持續(xù)性缺氧SGC-7901細(xì)胞側(cè)群細(xì)胞亞群(1.4-fold increase，P＜0.05)。
　　(2)缺氧培養(yǎng)腫瘤球中，HIF-1α的表達(dá)顯著高于正常培養(yǎng)的腫瘤球。OCT4表達(dá)定位于細(xì)胞核，缺氧培養(yǎng)的腫瘤球中其表達(dá)顯著高于正常培養(yǎng)的腫瘤球，且與HIF-1α存在共定位關(guān)系;Nestin表達(dá)定位于細(xì)胞膜，缺氧培養(yǎng)的腫瘤球中其表達(dá)顯著高于正常培養(yǎng)的腫瘤球，且與HIF-1α存在共定位關(guān)系。
　　結(jié)論：

29、　　1、HIF-1α廣泛表達(dá)于胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶中，對(duì)胃癌生物學(xué)行為產(chǎn)生重要影響。
　　2、HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)是影響胃癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　3、HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)與某些腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物OCT4及Nestin的表達(dá)呈正相關(guān)，參與了缺氧微環(huán)境對(duì)胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控。
　　4、缺氧微環(huán)境下HIF-1α調(diào)控胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞，增強(qiáng)其自我更新能力，減弱其多向分化能力。
　　5、腹膜乳斑是適合胃癌干細(xì)胞樣