Angiogenin對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能的影響及相關(guān)miRNA機制研究.pdf

1、滋養(yǎng)細(xì)胞（TB）是構(gòu)成哺乳動物胎盤組織的重要功能細(xì)胞，在正常早期妊娠過程中，滋養(yǎng)細(xì)胞通過“節(jié)制性”的“生理侵襲”能力到達子宮肌層約1/3處的母體蛻膜組織，促使螺旋動脈重鑄、擴張，進而滿足正常生理妊娠過程中母胎間的營養(yǎng)供給和血液供應(yīng)。正常生理狀態(tài)下，滋養(yǎng)細(xì)胞的這種“生理性侵襲”具有明顯的時間性和空間性，即滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲功能僅發(fā)生在妊娠早期階段，在妊娠12周時達到高峰，然后逐漸減弱在妊娠14-20周時基本結(jié)束；同時滋養(yǎng)細(xì)胞僅侵襲到子宮肌層1

2、/3處，而對深層組織無影響。病理狀態(tài)下，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能異常將直接導(dǎo)致妊娠相關(guān)疾病的發(fā)生，如滋養(yǎng)細(xì)胞過度侵襲，破壞周圍組織會導(dǎo)致絨毛膜癌等腫瘤疾病的發(fā)生；而在子癇前期（PE）發(fā)病過程中，由于多種因素共同作用導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞植入深度不足，進而使螺旋動脈的植入和重鑄受到限制，最終導(dǎo)致流產(chǎn)、胎盤缺血、發(fā)育受限等。由此可見，滋養(yǎng)細(xì)胞的這種“生理性的侵襲功能”是受精卵的成功植入和胚胎發(fā)育的重要前提，但目前關(guān)于其侵襲功能的具體調(diào)控機制尚不完全清楚。

3、r>　　本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，5％蛻膜基質(zhì)條件培養(yǎng)液（DSCM）處理后的HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯增強，同時MMP-2表達水平和酶活性顯著增強；而20%DSCM處理后HTR-8/SVneo細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯減弱，MMP-2表達及酶活性顯著降低。隨后我們通過蛋白芯片比對不同處理組中差異表達的細(xì)胞因子后發(fā)現(xiàn)，5%DSCM處理后的HTR8/SVneo細(xì)胞中angiogenin表達明顯增加，而20%DSCM處理后angi

4、ogenin表達顯著減低，angiogenin表達水平與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲能力密切相關(guān)，因此推測 angiogenin可能對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能發(fā)揮重要調(diào)控作用。
　　目的及方法:針對上述問題，在前期研究的基礎(chǔ)上，擬通過qPCR和Western blot方法明確Angiogenin在不同滋養(yǎng)細(xì)胞系和臨床樣本中的表達；在構(gòu)建過表達質(zhì)粒和siRNA的基礎(chǔ)上，使用Transwell實驗和劃痕實驗驗證Angiogenin對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功

5、能的調(diào)控作用；通過qPCR、Western blot、報告基因?qū)嶒灪凸δ芡炀葘嶒灥确椒U明參與Angiogenin調(diào)控的可能 miRNA機制；通過對正?；颊吆蚉E患者臨床樣本中Angiogenin等相關(guān)因子的相關(guān)性分析進一步論證Angiogenin及其相關(guān)miRNA機制在PE發(fā)病中的作用。
　　結(jié)果:
　　本課題研究結(jié)果可以分為以下4個部分，具體如下：
　　1. Angiogenin在不同DSCM處理組細(xì)胞和臨床樣本中

6、的表達分析：首先我們對芯片數(shù)據(jù)進行了qPCR驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與芯片結(jié)果一致，使用不同DSCM處理后滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力與細(xì)胞中Angiogenin的表達明顯相關(guān)，具有較強侵襲能力的絨毛膜癌細(xì)胞JEG-3中Angiogenin表達明顯高于正常滋養(yǎng)細(xì)胞HTR8/SVneo，子癇前期患者胎盤組織中Angiogenin表達顯著低于正常妊娠患者。本部分研究結(jié)果提示Angiogenin可能參與了滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能調(diào)控。
　　2. An

7、giogenin對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能的影響：為了證實Angiogenin對滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響，首先設(shè)計并構(gòu)建了Angiogenin的過表達質(zhì)粒pCMV-ANG，通過質(zhì)粒測序和Western blot結(jié)果證實其構(gòu)建成功；使用pCMV-ANG過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8/SVneo后，通過Transwell實驗和劃痕實驗發(fā)現(xiàn)其可以明顯促進滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，同時細(xì)胞中 MMP-2的表達顯著增加；使用 Angiogenin的si

8、RNA轉(zhuǎn)染HTR8/SVneo發(fā)現(xiàn)，通過siRNA降低Angiogenin表達后可以顯著抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能力，同時 MMP-2表達減低；為了證實 Angiogenin調(diào)控與MMP-2的相關(guān)性，使用MMP-2的siRNA設(shè)計了功能挽救實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，降低MMP-2表達后可以明顯抑制Angiogenin對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移能力的促進作用。本部分研究結(jié)果提示，Angiogenin可以促進滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移功能，其調(diào)控作用依賴于MMP

9、-2的表達。
　　3. Angiogenin調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞功能的 miRNA機制研究：為了進一步研究Angiogenin調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞機制，對以往文獻中miRNA芯片數(shù)據(jù)進行生物信息學(xué)分析和qPCR驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)細(xì)胞中差異表達的miR-519d-3p可能參與了其調(diào)控；使用miR-519d-3p mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染后的Transwell實驗和劃痕實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-519d-3p可以明顯抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移能

10、力；使用 miR-519d-3p mimics和MMP-2 siRNA等進行熒光素酶報告基因?qū)嶒?、qPCR、Western blot實驗和功能學(xué)挽救實驗后證實，MMP-23’UTR區(qū)域存在一個 miR-519d-3p的結(jié)合位點，miR-519d-3p可以抑制MMP-2的mRNA和蛋白表達，miR-519d-3p通過抑制其靶基因 MMP-2表達進而調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移功能；為了明確 Angiogenin與miR-519d-3p的相互調(diào)

11、控關(guān)系及其在調(diào)控功能中的作用，對不同Angiogenin處理組中miR-519d-3p表達譜進行分析，并使用Angiogenin siRNA和miR-519d-3p inhibitor進行功能學(xué)挽救實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Angiogenin可以抑制miR-519d-3p表達，其可以通過調(diào)控下游miR-519d-3p/MMP-2信號通路進而參與滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移功能調(diào)控。
　　4. Angiogenin、miR-519d-5p和MMP-

12、2在PE臨床樣本中的表達分析：為了證實Angiogenin/miR-519d-3p/MMP-2調(diào)控通路在臨床滋養(yǎng)細(xì)胞相關(guān)疾病如PE發(fā)病中的作用，我們針對正?；颊吆蛃PE患者胎盤組織中Angiogenin、miR-519d-3p和MMP-2表達進行了qPCR檢測和Pearson相關(guān)系數(shù)及線性回歸分析。qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常患者相比，sPE患者胎盤中Angiogenin和MMP-2表達明顯降低，而miR-519d-3p表達顯著升高；Pea

13、rson相關(guān)系數(shù)及線性回歸分析證實，sPE患者胎盤組織中Angiogenin、miR-519d-3p和MMP-2表達明顯相關(guān)，提示Angiogenin/ miR-519d-3p/MMP-2調(diào)控通路可能參與了臨床PE的發(fā)病過程。
　　結(jié)論:
　　通過以上本課題研究結(jié)果，最終有以下幾點發(fā)現(xiàn)：
　　1. Angiogenin參與了滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲和遷移功能的調(diào)控，它可以明顯促進滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和遷移功能，其作用依賴于調(diào)控下游MMP