雙酚A對母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞遷移的影響及其機(jī)制的研究.pdf

1、胎盤是母胎界面的重要組成部分，是胚胎和母體之間充分的物質(zhì)交換及營養(yǎng)運(yùn)輸?shù)闹匾Ｕ?。妊娠期母體子宮內(nèi)膜的蛻膜化和蛻膜功能的正常發(fā)揮對胚胎著床、妊娠的建立與維持起著至關(guān)重要的作用。滋養(yǎng)細(xì)胞被認(rèn)為是胎盤組織的重要組成部分，母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞與母體蛻膜之間的相互作用是成功妊娠的基礎(chǔ)。
　　滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜基質(zhì)細(xì)胞均能夠分泌趨化因子來促進(jìn)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移，同時滋養(yǎng)細(xì)胞也能夠分泌粘附分子及基質(zhì)金屬蛋白酶等來促進(jìn)自身的遷移及侵襲。胎盤發(fā)育異常能夠?qū)е?/p>

2、各種妊娠疾病，如胚胎發(fā)育遲滯、女性妊娠高血壓、子癇(clampsia)及自然流產(chǎn)(spontaneous abortion)等，可能由于滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力受損，蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的功能紊亂，從而導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞向母體蛻膜組織的侵襲受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致胚胎的氧氣、血液及營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足。
　　調(diào)查顯示，我國不孕不育發(fā)生率及自然流產(chǎn)率已經(jīng)達(dá)到了15％。作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(Environmental Endocrine Disruptors，EE

3、Ds)中的一種，雙酚A(Bisphenol A，BPA)在生活中廣泛存在，例如礦泉水瓶、嬰兒奶瓶、食品包裝及醫(yī)療器械等，研究發(fā)現(xiàn)，BPA也可以在母體血液、臍帶血以及羊水中檢測到。環(huán)境中低濃度的BPA進(jìn)入機(jī)體后可在卵泡液中富集，成年女性卵泡液中的BPA濃度是血漿的3-4倍，越來越多的證據(jù)表明，BPA與女性生殖功能損傷密切相關(guān)。
　　BPA在體內(nèi)難以降解，并具有干擾機(jī)體內(nèi)源性激素的特點，使其對生殖健康的影響備受關(guān)注。有研究表明，BPA

4、暴露可致母體竇腔卵泡數(shù)量改變，成熟卵泡和黃體數(shù)量明顯減少，從而導(dǎo)致生殖功能損傷。動物研究已經(jīng)證實了BPA具有干擾內(nèi)源性激素的作用，主要表現(xiàn)為雌激素效應(yīng)，而雌激素作為胚胎植入過程中的重要激素，其水平的偏差將導(dǎo)致植入紊亂、不孕和流產(chǎn)的發(fā)生。BPA還可以刺激NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞活性，提示BPA還有可能通過改變子宮內(nèi)膜免疫微環(huán)境，破壞胚胎植入，影響胚胎正常發(fā)育。但是，BPA對人妊娠早期蛻膜基質(zhì)細(xì)胞和胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞功能的影響及相關(guān)機(jī)制

5、尚不清楚。
　　目的:
　　探索BPA對母胎界面滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲功能的影響及其調(diào)控機(jī)制，為女性生殖相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供新的策略和思路。
　　方法:
　　1.總體設(shè)計:
　　首先建立小鼠流產(chǎn)模型，觀察BPA對孕鼠胚胎著床的影響，計算著床胚胎數(shù);其次，通過細(xì)胞侵襲實驗觀察BPA是否能在體外影響蛻膜基質(zhì)細(xì)胞（Decidual Stromal Cell，DSC）對滋養(yǎng)細(xì)胞的招募;通過檢測蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中趨化因子的表達(dá)

6、情況，明確BPA是否通過抑制蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中趨化因子的表達(dá)從而抑制其對滋養(yǎng)細(xì)胞的招募;通過檢測信號通路相關(guān)分子的活化情況推測BPA是通過哪條信號通路影響蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的功能;使用ERK的抑制劑U0126來確定ERK在BPA影響蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)趨化因子中的作用，再通過侵襲實驗進(jìn)一步驗證ERK在蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對滋養(yǎng)細(xì)胞的招募中的作用;使用G15及ICI182，780來阻斷GPR30及ERα/β，確定BPA是否通過GPR30及ERα/β來抑制蛻膜基

7、質(zhì)細(xì)胞中趨化因子的表達(dá)，再通過侵襲實驗驗證BPA是否通過GPR30及ERα/β來影響蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對滋養(yǎng)細(xì)胞的招募。另外，通過Transwell細(xì)胞侵襲實驗及細(xì)胞劃痕實驗來驗證BPA是否能夠直接影響絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo的侵襲及遷移;最后檢測BPA對HTR-8/SVneo細(xì)胞內(nèi)粘附分子、基質(zhì)金屬蛋白酶及基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑的表達(dá)的影響。
　　2.BPA對孕鼠胚胎著床的影響
　　將8周大ICR雌鼠雄鼠合籠，

8、于每天早晨8:00-9:00檢查雌鼠陰道栓，檢栓陽性記為孕0.5天，將孕鼠隨機(jī)分為DMSO對照組和BPA實驗組，于每天早晨8:00-9:00分別以DMSO和BPA灌胃至孕5.5天。在孕5.5天時，尾靜脈注射給與小鼠臺盼藍(lán)，處死小鼠并取子宮，統(tǒng)計胚胎著床數(shù)。
　　3.BPA對蛻膜基質(zhì)細(xì)胞招募滋養(yǎng)細(xì)胞的影響
　　BPA處理蛻膜基質(zhì)細(xì)胞72小時后，更換新鮮DMEM完全培養(yǎng)基，向預(yù)先鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室加入原代滋養(yǎng)細(xì)胞

9、或者滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR8/SVneo，共培養(yǎng)24小時，經(jīng)結(jié)晶紫染色后用正置顯微鏡觀察小室中侵襲的滋養(yǎng)細(xì)胞并進(jìn)行計數(shù)。
　　4.BPA對蛻膜基質(zhì)細(xì)胞趨化因子表達(dá)的影響
　　使用Real Time-PCR及酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)方法檢測BPA處理后，蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的趨化因子IL-6，CXCL6，CXCL8和CCL11的表達(dá)情況。
　　5.BPA影響蛻膜基質(zhì)細(xì)胞招募滋養(yǎng)細(xì)胞的通路研究
　　使用Western b

10、lotting方法分別檢測BPA處理蛻膜基質(zhì)細(xì)胞后，信號分子JNK，AKT，ERK，p38的磷酸化水平。用ERK特異性的阻斷劑U0126來確認(rèn)ERK在BPA抑制蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)趨化因子CXCL8中的作用，并通過侵襲實驗進(jìn)一步驗證ERK參與了BPA抑制蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對滋養(yǎng)細(xì)胞招募的過程。
　　分別使用G15及ICI182，780來阻斷GPR30及ERα/β通路，確定GPR30及ERα/β通路是否在BPA抑制蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)趨化因子方面

11、發(fā)揮作用;通過侵襲實驗進(jìn)一步驗證BPA是否通過GPR30及ERα/β通路影響蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對滋養(yǎng)細(xì)胞的招募。
　　6.BPA對滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及遷移的影響
　　通過Transwell實驗及細(xì)胞劃痕實驗來驗證BPA是否能夠直接影響絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo的侵襲及遷移。
　　7.BPA對滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的影響
　　使用BPA處理絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/SVneo，通過Western blotting檢測

12、HTR-8/SVneo細(xì)胞表達(dá)粘附分子、基質(zhì)金屬蛋白酶及基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑的情況。
　　結(jié)果:
　　BPA可以顯著抑制孕鼠的胚胎著床率。細(xì)胞侵襲實驗表明BPA能夠在體外影響蛻膜基質(zhì)細(xì)胞對滋養(yǎng)細(xì)胞的招募，這一過程是通過抑制蛻膜基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)CXCL8來實現(xiàn)的，BPA也能夠同時影響蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中IL-6，CXCL6及CCL11的表達(dá)。BPA能夠顯著激活蛻膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)包括ERK，AKT和p38在內(nèi)的多條信號通路。使用U012

13、6阻斷ERK激活可以恢復(fù)BPA引起的蛻膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)CXCL8表達(dá)的下降，同時滋養(yǎng)細(xì)胞的招募也得以恢復(fù)。使用G15，ICI182，780分別阻斷BPA與膜受體GPR30及核受體ERα/β的結(jié)合也能夠阻斷蛻膜基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的ERK激活，同時CXCL8的表達(dá)升高，滋養(yǎng)細(xì)胞的招募也得以恢復(fù)。另外，BPA還能夠直接通過影響滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)粘附分子、基質(zhì)金屬蛋白酶及基質(zhì)金屬蛋白酶的組織抑制劑的表達(dá)水平來抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的的侵襲及遷移。
　　結(jié)論: