原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)母胎界面調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對NK細(xì)胞的功能調(diào)控.pdf

1、胚胎對于母體來說是半同種異體移植物，母體免疫系統(tǒng)能否識別并耐受胚胎抗原，將直接影響妊娠的結(jié)局。這說明母胎間存在著免疫耐受，它受母胎界面局部免疫和孕婦系統(tǒng)免疫的共同調(diào)控，特別是母胎界面局部免疫，一旦這種母胎免疫耐受機(jī)制紊亂，URSA及其他病理妊娠就有可能發(fā)生。CD4+CD25+Treg細(xì)胞作為有免疫抑制功能的細(xì)胞群體，在維持妊娠期母胎免疫耐受平衡中扮演著重要角色，Treg細(xì)胞數(shù)量和功能的異常會引起母胎免疫耐受的失衡。但以CD4+CD25h

2、igb或CD4+CD25+Foxp3+亞型作為其分子標(biāo)志，并不能真實(shí)反應(yīng)體內(nèi)Treg細(xì)胞的水平。IL-7R(CD127)是T淋巴細(xì)胞膜表面受體，在Treg細(xì)胞中低表達(dá)或不表達(dá)，與Foxp3表達(dá)呈正相關(guān)，低表達(dá)CD127的Treg細(xì)胞同樣具有抑制自身效應(yīng)T細(xì)胞的能力，是新的更為理想的Treg細(xì)胞表面分子標(biāo)志。以此為標(biāo)記的Treg細(xì)胞的數(shù)量和功能變化對URSA患者蛻膜局部免疫耐受環(huán)境的影響，目前尚無相關(guān)研究。 蛻膜NK細(xì)胞在母體免疫

3、系統(tǒng)對胎兒同種抗原的識別中也有至關(guān)重要的作用。作為維持母胎免疫耐受的兩類主要免疫細(xì)胞，Treg細(xì)胞和NK細(xì)胞的數(shù)量和功能的平衡有利于正常妊娠的繼續(xù)。隨著對Treg細(xì)胞功能研究的深入，其對NK細(xì)胞功能的調(diào)控也漸受關(guān)注，在URSA中Treg細(xì)胞是否能夠引起NK細(xì)胞功能變化，目前尚無文獻(xiàn)報道。本課題主要以CD4+CD25+CD127dim/-為Treg細(xì)胞的表面標(biāo)記，從URSA患者蛻膜Treg細(xì)胞和NK細(xì)胞的表達(dá)頻率和功能變化為契入點(diǎn)，期望通

4、過實(shí)驗(yàn)研究，能夠揭示URSA母胎界面Treg細(xì)胞對NK細(xì)胞的功能調(diào)控機(jī)制，闡明它們在免疫耐受失衡導(dǎo)致流產(chǎn)中的作用機(jī)理。 1.蛻膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞的分離和體外擴(kuò)增 探討CD4+CD25+CD127dim/-作為蛻膜Treg細(xì)胞分子標(biāo)志的有效性及優(yōu)勢。以CD4+CD25+CD127dim/-三抗原標(biāo)記法作為識別蛻膜Treg細(xì)胞的分子標(biāo)志，用MACS分離純化CD4+CD25+CD127dim/

5、-Treg細(xì)胞，在體外用anti-CD3+anti-CD28+IL-2進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，采用實(shí)時熒光定量RT-PCR和FCM分析CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞胞內(nèi)Foxp3表達(dá)，用FCM檢測CD4+CD25high、CD4+CD25+Foxp3+和CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞在正常早孕人流婦女蛻膜淋巴細(xì)胞中的表達(dá)頻率。結(jié)果顯示：從蛻膜中分離出的CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞可在體

6、外擴(kuò)增，2周內(nèi)細(xì)胞數(shù)量可擴(kuò)增50倍，擴(kuò)增后的CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞表型穩(wěn)定，純度可達(dá)91.11％；擴(kuò)增后的CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞胞內(nèi)高表達(dá)Foxp3；正常早孕人流婦女蛻膜淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞表達(dá)頻率為2.97％±1.19％，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)頻率為2.02％±0.83％，CD4+CD25highTreg細(xì)胞表達(dá)頻率

7、僅為1.60％±0.80％； CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞表達(dá)頻率顯著高于CD4+CD25+Foxp3+和CD4+CD25highTreg細(xì)胞表達(dá)頻率，CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)頻率顯著高于CD4+CD25highTreg細(xì)胞表達(dá)頻率。CD4+CD25+CD127dim/-是新鮮分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)Treg細(xì)胞的有效標(biāo)志，以此為標(biāo)志能更加準(zhǔn)確全面地反映體內(nèi)Treg細(xì)胞水平，并便于分選獲得大量Tre

8、g細(xì)胞，為Treg細(xì)胞的功能研究奠定基礎(chǔ)。 2.URSA蛻膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞的表達(dá)頻率和功能研究 比較CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞在正常早孕婦女與URSA患者蛻膜中的表達(dá)頻率和功能變化，揭示CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞對URSA患者蛻膜局部免疫耐受環(huán)境的影響。留取URSA組(URSA患者21例)和對照組(正常早孕人流婦女30例)蛻膜組織，并制備

9、成DMC，采用FCM分析兩組蛻膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞的表達(dá)頻率及CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞胞內(nèi)Foxp3，IL-10和TGF-β表達(dá)水平；體外增殖試驗(yàn)檢測CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞對自身效應(yīng)T細(xì)胞的增殖抑制功能；通過體外培養(yǎng)抗體封閉，觀察IL-10和TGF-β在介導(dǎo)CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞免疫抑制功能中的作用。結(jié)果顯示：URSA中蛻膜

10、CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞表達(dá)頻率顯著降低，CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞表達(dá)頻率也顯著降低，但CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞表達(dá)頻率要明顯高于CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞表達(dá)頻率；URSA蛻膜中CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞對自體效應(yīng)性T細(xì)胞的增殖抑制作用顯著下降，CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞內(nèi)Foxp3，IL-10和TGF-β表達(dá)頻率均明

11、顯降低；抗IL-10和TGF-β抗體可部分阻斷蛻膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞的免疫抑制功能。蛻膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞表達(dá)頻率降低，在IL-10和TGF-β介導(dǎo)下，CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞免疫抑制功能減弱，引起母胎免疫耐受平衡紊亂，是URSA發(fā)病的主要原因之一。 3.URSA蛻膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞對NK細(xì)胞的功能調(diào)控

12、 分析URSA患者蛻膜CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷毒性和NK細(xì)胞胞內(nèi)因子產(chǎn)生的影響，探討CD4+CD25+CD127dim/-Treg細(xì)胞調(diào)控NK細(xì)胞功能在母胎免疫耐受中的作用。采用FCM法檢測URSA組和對照組NK細(xì)胞兩種亞群的分布；用LDH釋放實(shí)驗(yàn)測定CD4+CD25+CD127dim/-Treg和NK細(xì)胞共培養(yǎng)后NK細(xì)胞毒性變化；FCM法測定CD4+CD25+CD127dim/-Treg和N

13、K細(xì)胞共培養(yǎng)后NK細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ、Perforin產(chǎn)生情況。結(jié)果顯示：URSA組蛻膜中CD56+CD16-NK細(xì)胞表達(dá)頻率較對照組明顯減少；URSA組活化NK細(xì)胞CD3-CD56+CD69+表達(dá)頻率增加，NK細(xì)胞胞內(nèi)IFN-γ、Perforin的產(chǎn)生明顯增多，NK細(xì)胞殺傷毒性作用明顯高于對照組；CD4+CD25+CD127dim/-Treg對NK細(xì)胞功能有抑制作用，URSA組Treg細(xì)胞對NK細(xì)胞殺傷毒性的抑制作用明顯降低，對NK細(xì)

14、胞胞內(nèi)IFN-γ、Perforin的產(chǎn)生抑制作用下降；正常功能Treg細(xì)胞可以抑制URSA患者NK細(xì)胞毒性至正常水平，功能降低的Treg細(xì)胞對正常早孕婦女NK細(xì)胞毒性抑制作用也較弱。URSA中Treg細(xì)胞數(shù)量和免疫抑制功能的下降，引起NK細(xì)胞的活化異常和毒性增加，最終導(dǎo)致免疫耐受失衡，流產(chǎn)發(fā)生。 我們的研究結(jié)果表明：CD4+CD25+CD127dim/-是蛻膜Treg的有效分子標(biāo)志，CD4+CD25+CD127dim/-Treg

15、細(xì)胞和NK細(xì)胞在原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)發(fā)生時，共同參與母胎界面局部免疫的調(diào)節(jié)：URSA中Treg細(xì)胞數(shù)量下降和免疫抑制功能降低，導(dǎo)致NK細(xì)胞的異?；罨投拘栽黾?，引起母胎界面免疫耐受狀態(tài)失衡。這一結(jié)論不僅豐富了妊娠免疫耐受理論，而且進(jìn)一步加深了對妊娠生理過程的認(rèn)識，也將為研究某些病理性妊娠的發(fā)病機(jī)制提供新的線索，為制定疾病的防治策略提供依據(jù)。當(dāng)然，妊娠是極為復(fù)雜而又受到精細(xì)調(diào)控的生命現(xiàn)象，必然存在多重機(jī)制以確保妊娠的建立和維持，還有待于我們