轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子E2F對Op18基因表達(dá)及腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為作用研究.pdf

1、Op18是一種重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，該蛋白在細(xì)胞分化、組織再生、修復(fù)及發(fā)育中，尤其是在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及決定表型上具有重要作用及意義，該基因及其表達(dá)產(chǎn)物是一個極具吸引力的惡性腫瘤生物治療新靶點(diǎn)。 但是，op18在腫瘤組織中過表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。核轉(zhuǎn)錄因子E2F對細(xì)胞周期的調(diào)控至關(guān)重要，研究顯示，op18基因啟動子上存在E2F的結(jié)合位點(diǎn)，說明op18是轉(zhuǎn)錄因子E2F調(diào)控的靶基因。本實(shí)驗(yàn)旨在探討轉(zhuǎn)錄因子E2F對op18基因

2、的調(diào)控機(jī)制及對腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的效應(yīng)機(jī)制，從而為腫瘤的生物治療尋找新的技術(shù)方法。 目的：設(shè)計合成轉(zhuǎn)錄因子E2F啞鈴形圈套寡核苷酸（Decoy ODNs圈套寡核苷酸）并構(gòu)建腫瘤特異性survivin啟動子調(diào)控的E2F1 siRNA逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，探討轉(zhuǎn)錄因子E2F對腫瘤細(xì)胞而非正常細(xì)胞中op18基因調(diào)控機(jī)理及對腫瘤細(xì)胞增殖的影響。 方法： (1)將體外設(shè)計合成的啞鈴形圈套寡核苷酸在陽離子脂質(zhì)體Lipofectam

3、ineTM2000介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞（MKN-45細(xì)胞和A549細(xì)胞），用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中op18 mRNA表達(dá)水平，通過MTT實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的生長抑制情況，TUNEL法觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡情況。 (2)利用重組DNA技術(shù)，將survivin啟動子和E2F1 siRNA基因序列亞克隆至逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSN中，重組質(zhì)粒pLXSN/Surp/E1在脂質(zhì)體介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染PA317包裝細(xì)胞，G418篩選，直至出現(xiàn)抗性克隆，擴(kuò)大培

4、養(yǎng)，用NIH3T3測定病毒滴度，將重組病毒感染人肺癌細(xì)胞A549，G418篩選出抗性克隆，命名為A549/E1，利用PCR對A549/E1細(xì)胞進(jìn)行鑒定重組逆轉(zhuǎn)錄病毒是否整合到A549/E1細(xì)胞基因組中。 (3)用RT-PCR及Western blot法鑒定A549/E1細(xì)胞中op18表達(dá)。 (4)測定細(xì)胞增殖曲線觀察細(xì)胞增殖情況，流式細(xì)胞儀技術(shù)(FCM)分析轉(zhuǎn)導(dǎo)后細(xì)胞凋亡情況。 結(jié)果： (1)啞鈴形圈套寡

5、核苷酸被成功轉(zhuǎn)染入腫瘤細(xì)胞（MKN-45細(xì)胞和A549細(xì)胞），RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)啞鈴形圈套寡核苷酸處理后的腫瘤細(xì)胞中op18mRNA表達(dá)水平明顯低于對照組，MTT實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖速度下降而空白對照組無明顯變化，TUNEL凋亡染色可見凋亡細(xì)胞。 (2)測序、限制性酶切分析及PCR方法鑒定顯示，成功構(gòu)建腫瘤特異性survivin啟動子調(diào)控的E2F1siRNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體；獲得高滴度產(chǎn)毒細(xì)胞株C28，滴度為2.0×106

6、/ml，重組病毒感染的A549細(xì)胞PCR分析證明目的基因已整合至A549/E1細(xì)胞基因組中；RT-PCR 、Western blot法鑒定A549/E1細(xì)胞中op18表達(dá)明顯下調(diào)；A549/E1細(xì)胞與A549/0細(xì)胞、未感染的A549細(xì)胞比較，A549/E1生長速度顯著被抑制；流式細(xì)胞儀技術(shù)(FCM)分析顯示A549/E1細(xì)胞調(diào)亡明顯增加。 結(jié)論：啞鈴形圈套寡核苷酸能特異性抑制E2F轉(zhuǎn)錄因子對op18基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，進(jìn)而抑制op