HPV16-18 E6-E7基因沉默對(duì)SiHa-HeLa細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究.pdf

1、目的：高危型人乳頭瘤病毒(highriskhumanpapillomavirus，HR-HPV)的E6/E7是引起宮頸癌的主要致癌基因，在宮頸癌篩查與HPV治療中具有重大的臨床意義，目前E6/E7在宮頸癌致癌中機(jī)制尚不十分明確。本研究目的在于通過觀察E6/E7基因沉默對(duì)于宮頸癌細(xì)胞株生物學(xué)行為的影響，包括體外的增殖、凋亡、侵襲和裸鼠體內(nèi)成瘤能力，同時(shí)觀察E6/E7沉默后宮頸癌細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物順鉑耐受性的改變以及細(xì)胞內(nèi)hTERC基因表達(dá)的

2、變化，探討HPVE6/E7在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，并推測其發(fā)揮作用可能的分子機(jī)制，初步評(píng)價(jià)shRNA干擾對(duì)于HPV感染和抗腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：1.shRNA質(zhì)粒構(gòu)建針對(duì)HPV16與HPV18E6/E7mRNA序列，分別設(shè)計(jì)3對(duì)shRNA特異性序列，構(gòu)建shRNA載體共6對(duì)，利用電擊轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染HPV16整合的SiHa細(xì)胞株與HPV18整合的HeLa細(xì)胞株，篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單細(xì)胞克隆細(xì)胞株（pSi-16-NC,p

3、Si-16-1,pSi-16-2,pSi-16-3與pSi-18-NC,pSi-18-1,pSi-18-2,pSi-18-3）。
　　2.體外研究：①應(yīng)用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后24h、48h、72h，HPV16與HPV18E6與E7mRNA表達(dá)；②應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中HPV16與HPV18E6與E7mRNA表達(dá)；③應(yīng)用Western-blot檢測轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中p53、pRb和p16抑癌蛋

4、白的表達(dá)；④應(yīng)用MTT測定轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的生長增殖能力；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力；流式細(xì)胞技術(shù)檢測shRNA轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的周期分布；⑤順鉑作用48h后流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞總凋亡與早、晚期凋亡；⑥應(yīng)用FISH檢測shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)hTERC基因表達(dá)變化。
　　3.體內(nèi)研究：應(yīng)用SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株分別建立裸鼠人宮頸癌模型（2×106個(gè)細(xì)胞/只）。①通過比

5、較腫瘤體積和重量，觀察E6/E7沉默對(duì)裸鼠腫瘤生長的抑制作用；②應(yīng)用FISH檢測shRNA轉(zhuǎn)染后癌組織中hTERC基因表達(dá)變化。
　　結(jié)果：1.shRNA質(zhì)粒的干擾作用：針對(duì)E6/E7設(shè)計(jì)的6組pSi-shRNA載體能夠有效地抑制HPV16E6/E7mRNA與HPV18E6/E7mRNA的表達(dá)。抑制效果因選擇的靶點(diǎn)位置不同而存在差異。在SiHa細(xì)胞中，pSi-16-1,pSi-16-2,pSi-16-3對(duì)E6和E7的抑制率分別為8

6、5.4％與54.9%；91.9%與63.2%；84.7%與71.1%。在HeLa細(xì)胞中，pSi-18-1,pSi-18-2,pSi-18-3對(duì)E6和E7的抑制率分別為91.3%與55.8%；90.4%與7.8%；87.2%與81.0%。
　　2.體外研究：qRT①-PCR結(jié)果顯示，pSi-shRNA質(zhì)粒能夠有效沉默HPV16/18E6與E7mRNA的表達(dá)，見結(jié)果一；②轉(zhuǎn)染前后SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中p53、pRb和p16抑癌蛋

7、白的表達(dá)均有上調(diào)；MTT③試驗(yàn)結(jié)果顯示，E6/E7沉默使SiHa細(xì)胞和HeLa細(xì)胞的增殖活性降低，部分組（pSi-16-2,pSi-16-3,pSi-18-3）與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；Transwell④實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，E6/E7沉默使腫瘤細(xì)胞遷移能力下降,部分組（pSi-16-2,pSi-16-3,pSi-18-1,pSi-18-2,pSi-18-3）與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.05）；⑤細(xì)胞周期檢測結(jié)果表明E6

8、/E7基因沉默后，G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例降低；⑥檢測順鉑作用48小時(shí)后細(xì)胞凋亡情況顯示，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞總調(diào)亡率增加，表明E6/E7沉默使細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性增加；hTERC⑦基因檢測發(fā)現(xiàn)E6/E7基因沉默使hTERC表達(dá)下調(diào)，正常細(xì)胞比例增加。
　　3.體內(nèi)研究：E6/E7①沉默能抑制宮頸癌細(xì)胞的在裸鼠體內(nèi)的生長，抑制裸鼠腫瘤的體積，與對(duì)照組比較有顯著性差異（P＜0.01）；E6/E7②抑制降低了裸鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞hTER

9、C基因的表達(dá)，使hTERC基因正常表達(dá)的細(xì)胞比例增加。
　　結(jié)論：重組質(zhì)粒pSi-shRNA能夠使E6/E7在宮頸癌細(xì)胞株SiHa與HeLa細(xì)胞中的表達(dá)下調(diào)，其抑制率可達(dá)到60%~90%。E6/E7基因轉(zhuǎn)錄水平的沉默使宮頸癌細(xì)胞SiHa與HeLa細(xì)胞中抑癌蛋白p53、pRb、p16的表達(dá)增加，細(xì)胞生長受抑制，遷移能力降低，同時(shí)使處于G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例減少。綜上表明E6/E7基因在宮頸癌細(xì)胞生長、增殖、遷移以及細(xì)