氯化高鐵血紅素對血管內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化Erk1-2的誘導(dǎo)作用及其相關(guān)機(jī)制.pdf

1、目的:正常人體紅細(xì)胞中含有血紅蛋白，當(dāng)紅細(xì)胞被代謝破壞后釋放血紅蛋白，血紅蛋白繼而被氧化釋放出血紅素(heme)分子。heme可以直接進(jìn)入血管內(nèi)皮細(xì)胞膜，使得細(xì)胞膜更易發(fā)生氧化損傷最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。而內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)氧化損傷，凋亡的發(fā)生與一系列疾病密切相關(guān)，包括動脈粥樣硬化、缺血復(fù)灌損傷以及伴隨有血管內(nèi)溶血的一些器官損傷等。然而Balla等發(fā)現(xiàn)heme進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞一段時間后可以對抗后面的H2O2以及低密度脂蛋白氧化所致內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷

2、。有文獻(xiàn)證實急性的heme釋放引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，刺激內(nèi)皮細(xì)胞血紅素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)的合成增加，HO-1可以分解heme生成一氧化碳(CO)、鐵離子和膽綠素(biliverdin)，膽綠素很快在體內(nèi)代謝成為膽紅素，膽紅素是目前公認(rèn)的抗氧化劑之一。因此有人認(rèn)為血紅素有此抗氧化作用應(yīng)歸屬于它對HO-1的誘導(dǎo)作用。 氯化高鐵血紅素(hemin)屬于血紅素的一種，目前發(fā)現(xiàn)其具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。有人發(fā)

3、現(xiàn)hemin可以降低原發(fā)性高血壓大鼠的血壓，也可以減輕由于缺氧導(dǎo)致的肺動脈高壓。Togane等人發(fā)現(xiàn)hemin可以對抗球囊損傷模型對血管平滑肌的損傷，同時Aizawa等人證明hemin可以對抗球囊損傷模型引起的鼠頸動脈損傷。hemin對血管系統(tǒng)的保護(hù)作用機(jī)制未明，可能與其誘導(dǎo)HO-1的合成有關(guān)。 Erk1/2是絲裂原蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)家族成員之一。MAPK家族屬于

4、絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，廣泛參與到多種胞外刺激的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑。哺乳動物細(xì)胞中MAPK家族主要包括：Erk1/2，c-Jun氨基末端激酶(c-Junamino-terminalkinases，JNK)以及p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)。其中Erk1/2主要是參與各種生長因子的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，JNK和p38MAPK主要是參與各種應(yīng)激刺激的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)。 hemin是否與血管內(nèi)皮細(xì)胞中重要的信號分子Erk1/2的磷酸化水

5、平改變存在一定聯(lián)系目前尚未見報道。因此本實驗的目的是探討hemin對血管內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化Erk1/2是否有誘導(dǎo)作用；有研究表明H2O2可以引起細(xì)胞中Erk1/2磷酸化，因此在本實驗中我們將進(jìn)一步觀察H2O2是否參與了hemin對內(nèi)皮細(xì)胞Erk1/2的磷酸化作用，以及hemin誘導(dǎo)產(chǎn)生的HO-1和它自身的代謝產(chǎn)物是否也參與了hemin對血管內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化Erk1/2的誘導(dǎo)。 方法1.細(xì)胞藥物處理在細(xì)胞血清饑餓16h后給予不同濃度he

6、min(1，5，10，25，50μmol/L)或100μmol/LH2O2于37℃、5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同時間后，收集細(xì)胞觀察Erk1/2磷酸化情況。 ZnPP為HO-1阻斷劑，Hb為CO清除劑，DFOM為鐵離子鰲合劑。在本實驗中，將HUVEC細(xì)胞在無血清條件下首先分別與5μmol/LZnPP、25μmol/LHb、50μmol/LDFOM共育2h后，然后給予10μmol/Lhemin與HUVEC細(xì)胞共育2h后，收集細(xì)胞

7、，觀察Erk1/2的磷酸化情況。 2.Westernblot將處理后的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化收集后，加入細(xì)胞裂解液裂解，離心取蛋白沉淀。Lowry法測蛋白濃度。十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5％脫脂奶粉封閉硝酸纖維素膜2h，洗膜后加入一抗，4℃反應(yīng)過夜，次日洗膜3次共15min，隨后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫反應(yīng)1h。洗膜，加入ECL顯色劑，X片顯影。 3.流式細(xì)胞儀分別

8、收集經(jīng)不同藥物濃度處理組和對照組處理細(xì)胞，收集各組細(xì)胞均勻打散，用PBS反復(fù)沖洗3～5次，置于70％乙醇中4℃固定，用碘化丙啶(PI)對樣本DNA熒光染色，然后采用流式細(xì)胞儀作細(xì)胞周期采樣分析及細(xì)胞凋亡分析。 4.MTT用RMPI1640(含10％新生牛血清)細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/L的細(xì)胞懸液，加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于37℃、5％CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)24h后，棄培養(yǎng)上清液，用37℃預(yù)溫的RMPI1640沖洗1次

9、。實驗組藥物的終濃度分別為10μmol/Lhemin、10μmol/Lbiliverdin，每個藥物濃度做6個復(fù)孔，空白對照組除未加任何藥物外，其余條件完全一致。于用藥后24h加入pH7.4PBS配制的5g/LMTT20μl/孔，再置37℃、5％CO2條件下4h。棄去上清液，加入DMSO0.2ml/孔，混勻30min后在酶聯(lián)檢測儀上570nm波長處測A570值，據(jù)此計算各藥物對HUVEC細(xì)胞生長的影響。 結(jié)論10μmol/Lhe