IgA腎病尿蛋白質譜HPLC-MS-MS的初步分析.pdf

1、目的：研究IgA腎病患者尿液蛋白質譜特點，結合腎活檢技術對不同病理類型及IgA腎病的不同階段的蛋白質譜進行比較，尋找具有高度特異性與敏感性的尿液蛋白質，探討蛋白質譜技術對該疾病的臨床診斷意義。 方法：取8例清晨空腹無菌尿液標本，避免污染和蛋白質酶解，進行4℃3000×g離心5分鐘以除去細胞及相關成分，取上清液用0．45μm的微孔超濾膜過濾以除去大顆粒雜質，再用-20℃預冷丙酮按照標本體積：丙酮體積為4：1的比例迅速加入進行蛋白沉

2、淀，置于-20℃過夜后，經4℃7000×g高速離心30分鐘，棄上清液，留取含尿蛋白的沉淀物，-106℃真空干燥濃縮。PBS充分溶解后用Bradford法（考馬斯亮藍）進行濃度測定，計算出樣品的蛋白濃度，取0．8g樣品充分酶解后調整蛋白濃度為0．8μg/μl，行HPLC除鹽，測得肽峰，獲取含肽混合液，-106℃真空干燥濃縮，再行LC-MS/MS（LCQ）質譜分析，設定二級質譜質/荷優(yōu)化范圍為400-2000，質譜分析時間210分鐘，洗脫時

3、間30分鐘，獲得質譜肽序列結果采用BioWorks軟件的SEQUEST計算方法行數(shù)據(jù)庫檢索，所用的庫為ipi．human，v3．05。 結果：成功的獲得了重復性比較好的尿液蛋白質譜肽序列圖譜，獲得IgA腎病尿蛋白質共194個，不同病理類型患者的尿蛋白質中有15個具有高度特異性的蛋白質，在International Protein Index（IPI）human數(shù)據(jù)庫中鑒定獲得13種蛋白質；病理分型為局灶節(jié)段硬化型（Lee氏Ⅲ型）

4、有28種特征表達的蛋白質，局灶增生硬化型（Lee氏Ⅱ型）有36種特征蛋白質表達；病理類型為中度系膜增生型（Lee氏Ⅰ型）患者應用激素治療2月后患者的尿蛋白臨床定量明顯減少，但蛋白質譜鑒定其種類無明顯減少，治療前后有36種共同表達蛋白質。 結論：本實驗采用LC-MS/MS質譜分析的方法鑒定IgA腎病尿液蛋白質，成功的獲得了該疾病的多肽序列質譜圖，最終得到194個蛋白質。大多數(shù)是糖蛋白；尿液蛋白質組中的免疫球蛋白分泌片段、結合珠蛋白