腸炎后內(nèi)臟高敏感分子調(diào)控異常的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子參與腸炎后結(jié)腸高敏感的調(diào)節(jié)
　　 背景：
　　 炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)和腸易激綜合征(Irritablebowel syndrome，IBS)患者常伴有反復(fù)發(fā)作性腹痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前認(rèn)為內(nèi)臟高敏感是IBD和IBS患者腹痛發(fā)生的主要病理生理機(jī)制，其發(fā)生機(jī)制尚有待明確。內(nèi)臟感覺(jué)通過(guò)胞體位于脊髓背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root gan

2、glia，DRG)的脊髓內(nèi)臟傳入纖維傳遞到次級(jí)感覺(jué)神經(jīng)元，進(jìn)而投射到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。內(nèi)臟敏感性的變化主要可歸結(jié)為兩個(gè)因素，外周敏感化和中樞敏感化。各種原因引起的感覺(jué)神經(jīng)末梢和初級(jí)傳入神經(jīng)元的致敏可以誘導(dǎo)中樞敏感化。
　　 臨床上約1/3的IBS患者可追溯到有既往腸道感染史，這類(lèi)病人稱(chēng)為感染后腸易激綜合征(post-infectious IBS，PI-IBS)。急性腸道感染后可遺留感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)等腸道功能紊亂。對(duì)PI-IBS患者的臨床研

3、究發(fā)現(xiàn)其結(jié)腸標(biāo)本上皮通透性增加，炎性細(xì)胞和炎癥介質(zhì)增多。炎癥對(duì)感覺(jué)神經(jīng)元具致敏作用。炎癥后腸傳入神經(jīng)的致敏可能在IBD和PI-IBS患者內(nèi)臟高敏感的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。明確參與這一致敏機(jī)制的關(guān)鍵分子，將為臨床治療提供新的靶點(diǎn)，從而有助于腹痛癥狀的緩解。
　　 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)家族中的一員，在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)均有表達(dá)，既往研究認(rèn)為

4、，BDNF可調(diào)控突觸可塑性和維持神經(jīng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，進(jìn)而參與學(xué)習(xí)、記憶等多項(xiàng)功能。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)BDNF也可參與調(diào)控痛覺(jué)的傳導(dǎo)。BDNF可在DRG細(xì)胞中表達(dá)，在多種炎癥性軀體痛模型中證實(shí)BDNF表達(dá)上調(diào)，應(yīng)用BDNF抗體可抑制軀體痛覺(jué)過(guò)敏。
　　 BDNF不僅在神經(jīng)系統(tǒng)分布，在外周也廣泛表達(dá)，研究報(bào)道BDNF可分布于心臟、肺、膀胱和結(jié)腸等多個(gè)內(nèi)臟器官的上皮層，但BDNF的受體TrkB和P75受體不在上皮層表達(dá)，而是選擇性表達(dá)在神經(jīng)

5、系統(tǒng)內(nèi)。因此推測(cè)內(nèi)臟上皮細(xì)胞合成的內(nèi)源性BDNF通過(guò)作用于支配內(nèi)臟的神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。
　　 本研究中，我們首次結(jié)合BDNF基因敲除小鼠探討B(tài)DNF對(duì)小鼠內(nèi)臟敏感性的影響。并應(yīng)用結(jié)腸內(nèi)灌注三硝基苯磺酸(trinitro benzene sulfonic acid，TNBS)，誘導(dǎo)建立內(nèi)臟高敏感，進(jìn)一步分析BDNF是否參與炎癥后腸傳入神經(jīng)致敏。
　　 目的：
　　 研究腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在腸炎后結(jié)腸高敏感中的作用。

6、
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組本研究所用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物根據(jù)BDNF基因型和是否造成炎癥狀態(tài)共分為四組，BDNF+/+(野生型)/生理鹽水對(duì)照組，BDNF+/+/TNBS炎癥組，BDNF+/-/生理鹽水對(duì)照組，BDNF+/-/TNBS炎癥組。
　　 2.三硝基苯磺酸灌腸(trinitro benzene sulfonic acid，TNBS)造結(jié)腸炎模型：小鼠灌腸前24小時(shí)禁食不禁水，0.1mL1.75mg經(jīng)肛門(mén)

7、注入降結(jié)腸，導(dǎo)管末端距肛門(mén)4cm，結(jié)束后小鼠保持倒立姿勢(shì)30s。對(duì)照組應(yīng)用同等體積的生理鹽水。
　　 3.結(jié)腸病理組織學(xué)檢查：小鼠灌腸7天后，過(guò)量麻醉處死，取降結(jié)腸遠(yuǎn)端3cm的一半，甲醛固定，石蠟包埋后行HE染色和組織學(xué)評(píng)分。
　　 4.髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性檢測(cè)：使用部分降結(jié)腸遠(yuǎn)端標(biāo)本，稱(chēng)重、勻漿，按照MPO試劑盒說(shuō)明操作。
　　 5.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme link

8、ed immunosorbent assay，ELISA)：取支配結(jié)腸的胸腰部(thoracolumbar，TL)DRG(T10-L1)和腰骶部(Lumbosacral，LS)DRG(L6-S1)和部分降結(jié)腸遠(yuǎn)端標(biāo)本，裂解并蛋白定量后，按照ELISA試劑盒的說(shuō)明操作。BDNF濃度表示為ng/g全蛋白。
　　 6.直結(jié)腸擴(kuò)張(Colorectal distension，CRD)法檢測(cè)結(jié)腸敏感性。
　　 小鼠乙醚輕度麻醉后，

9、將特制的2cm長(zhǎng)度球囊輕插入降結(jié)腸，球囊近端距肛門(mén)約0.5cm。
　　 (1)當(dāng)小鼠充分蘇醒并適應(yīng)后，分別在0，15，30，45，60，80mmHg壓力下進(jìn)行結(jié)腸球囊擴(kuò)張。每次擴(kuò)張持續(xù)20s，間隔4分鐘。在遞增的壓力下，記錄各個(gè)壓力時(shí)的腹壁收縮反射(abdominal withdrawal response，AWR)評(píng)分。所有測(cè)量均重復(fù)3次。AWR評(píng)分系統(tǒng)：0：對(duì)球囊擴(kuò)張無(wú)反應(yīng)；1：身體靜止不動(dòng)或頭部運(yùn)動(dòng)減少；2：腹部肌肉收縮；

10、3：腹部抬高；4：骨盆抬起，身體呈弓形。
　　 (2)連接球囊的導(dǎo)管和壓力表、注射器扎緊，通過(guò)三通管連接。注射器內(nèi)抽入空氣，當(dāng)小鼠充分蘇醒并適應(yīng)5分鐘后，注射空氣，逐漸增加壓力以測(cè)量初始感覺(jué)閾值和疼痛閾值，所有測(cè)量均重復(fù)3次。小鼠接受直腸擴(kuò)張時(shí)，如身體靜止不動(dòng)，頭部運(yùn)動(dòng)減少時(shí)，記錄此壓力值，為小鼠的初始感覺(jué)閾值。如腹部肌肉收縮時(shí)，記錄此壓力值，為小鼠的疼痛閾值。
　　 結(jié)果：
　　 1.對(duì)于不同基因型的小鼠，TN

11、BS均可誘導(dǎo)明顯的結(jié)腸炎癥，組織學(xué)切片表現(xiàn)為節(jié)段性潰瘍形成，腸黏膜中度充血水腫，大量炎性白細(xì)胞浸潤(rùn)和部分上皮壞死脫落。
　　 2.組織學(xué)評(píng)分：BDNF+/+/TNBS炎癥組與BDNF+/-/TNBS炎癥組的組織學(xué)評(píng)分無(wú)顯著性差異。
　　 3.髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性評(píng)分，BDNF+/+/TNBS炎癥組與BDNF+/-/TNBS炎癥組之間無(wú)顯著性差異。
　　 4.ELISA法檢測(cè)支配結(jié)腸的背根DRG內(nèi)BDNF表達(dá)

12、水平
　　 (1)非炎癥狀態(tài)下，BDNF+/-小鼠的TL與LS DRG的BDNF表達(dá)水平均約為野生型一半。
　　 (2)TNBS誘導(dǎo)的炎癥導(dǎo)致不同基因型小鼠炎癥后TL與LS DRG內(nèi)BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著性升高。
　　 (3)BDNF+/-炎癥小鼠上調(diào)的BDNF表達(dá)水平顯著低于野生炎癥小鼠上調(diào)的BDNF表達(dá)水平。
　　 (4)BDNF+/-/炎癥小鼠BDNF水平仍相對(duì)低于野生無(wú)炎癥小鼠。
　　

13、 5.ELISA法檢測(cè)遠(yuǎn)端結(jié)腸BDNF表達(dá)水平
　　 (1)非炎癥狀態(tài)下，BDNF+/-小鼠的BDNF表達(dá)水平均約為野生型一半。
　　 (2)TNBS誘導(dǎo)的炎癥導(dǎo)致不同基因型小鼠炎癥后結(jié)腸組織BDNF蛋白表達(dá)水平均顯著性升高。
　　 (3)BDNF+/-炎癥小鼠上調(diào)的BDNF表達(dá)水平顯著低于野生炎癥小鼠上調(diào)的BDNF表達(dá)水平。
　　 (4)BDNF+/-/炎癥小鼠BDNF水平和野生無(wú)炎癥小鼠之間無(wú)顯著性差

14、異。
　　 6.CRD檢測(cè)
　　 (1)比較不同擴(kuò)張壓力下小鼠的AWR評(píng)分。
　　 非炎癥狀態(tài)，在60mmHg以下BDNF+/-小鼠與野生小鼠對(duì)球囊擴(kuò)張的內(nèi)臟反應(yīng)性無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而在≥60 mmHg以上擴(kuò)張壓力時(shí)，BDNF+/-小鼠表現(xiàn)出顯著性降低的內(nèi)臟反應(yīng)性。
　　 在野生小鼠組，TNBS誘導(dǎo)炎癥導(dǎo)致內(nèi)臟反應(yīng)性明顯升高，表現(xiàn)為在≥30mmHg壓力時(shí)的內(nèi)臟高反應(yīng)性，而在<30mmHg壓力時(shí)炎癥組與鹽

15、水對(duì)照組內(nèi)臟反應(yīng)性無(wú)顯著性差異。
　　 在BDNF+/-小鼠組，TNBS誘導(dǎo)炎癥也可導(dǎo)致內(nèi)臟反應(yīng)性升高，但要在≥45mmHg以上壓力時(shí)，TNBS炎癥方表現(xiàn)出相對(duì)于鹽水對(duì)照組顯著性升高的反應(yīng)性。在<45mmHg壓力時(shí)BDNF+/-TNBS炎癥組與鹽水對(duì)照組無(wú)顯著性差異。
　　 炎癥狀態(tài)下，BDNF+/-炎癥小鼠對(duì)球囊擴(kuò)張后的內(nèi)臟反應(yīng)性相對(duì)于野生型炎癥小鼠顯著性降低，但仍高于野生鹽水組的內(nèi)臟反應(yīng)性。
　　 (2)比較

16、各組小鼠的初始感覺(jué)閾值和疼痛閾值
　　 非炎癥狀態(tài)下，BDNF+/-小鼠和野生小鼠之間無(wú)差異。
　　 炎癥后，BDNF+/-小鼠和野生小鼠相對(duì)于其各自的鹽水對(duì)照組的初始感覺(jué)和疼痛閾值均降低。
　　 BDNF+/-/TNBS鼠相對(duì)于野生/TNBS小鼠的初始感覺(jué)閾值和疼痛閾值較高；但仍低于野生鹽水對(duì)照組小鼠。
　　 炎癥后BDNF+/-炎癥小鼠的內(nèi)臟敏感性相對(duì)于野生型炎癥小鼠顯著性降低，但仍高于野生無(wú)炎癥小鼠

17、和BDNF+/-無(wú)炎癥小鼠的內(nèi)臟敏感性。提示BDNF的靶向敲除對(duì)炎癥后內(nèi)臟高敏感有部分抑制作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.無(wú)炎癥狀態(tài)下，與BDNF+/-小鼠比較，BDNF+/-小鼠結(jié)腸和DRG的BDNF表達(dá)水平降低，但結(jié)腸敏感性無(wú)顯著性變化，僅在球囊擴(kuò)張60mmHg以上時(shí)BDNF+/-小鼠表現(xiàn)為低反應(yīng)性。
　　 2.應(yīng)用三硝基苯磺酸建立結(jié)腸炎模型，發(fā)現(xiàn)炎癥后結(jié)腸及支配結(jié)腸的DRG內(nèi)BDNF表達(dá)增加，同時(shí)伴有結(jié)腸高