腸炎后腸系膜傳入神經敏感性變化及其機制的研究.pdf

1、本研究分為三部分： 第一部分：正常小鼠空腸腸系膜傳入神經對化學以及機械刺激的敏感性 目的：內臟傳入神經高敏感與功能性腸病和炎性腸病引起的的臨床癥狀有關。迷走神經和脊神經傳入纖維末梢對腸道局部的機械和化學刺激敏感，可以把腸道局部的感覺信息傳入中樞。在本部分實驗中我們建立離體記錄小鼠腸系膜傳入神經放電的實驗裝置，觀察小鼠腸系膜傳入神經對5-羥色胺、緩激肽以及機械刺激的放電反應，制備腸系膜傳入神經對5-羥色胺和緩激肽反應的劑量

2、效應曲線。 方法：C57BL/6小鼠，異氟烷吸入麻醉，腹部正中切口，取一段2厘米長帶有完整腸系膜的空腸。用特制的由灌流槽和記錄槽兩部分組成的器官浴槽記錄腸系膜傳入神經放電。將空腸段放入灌流槽，以克氏液持續(xù)灌流空腸(灌流液溫度32攝氏度，10毫升/分鐘，95％O2/5％CO2混合氣體持續(xù)通氣)?？漳c兩端分別插管固定，插管的頭端通過三通分別與微量灌流泵和壓力傳感器相連，插管的尾端與大氣相通，由空腸頭端向尾端以10ml/h的速度以克氏

3、液灌流腸腔。經過灌流槽和記錄槽之間的孔隙將腸系膜袢拉入記錄槽固定，在顯微鏡下從腸系膜血管束中仔細分離腸系膜神經，將分離好的神經與雙極鉑金電極的其中一個電極相連，另一個電極連接直徑與神經接近的結締組織。由電極引導出的神經放電信號和壓力傳感器引導的壓力信號分別輸入1902單通道放大器，放大后的電信號以及腸內壓信號均被輸入1401A/D轉換器，1401A/D轉換器直接與記錄電腦相連，將信號輸入電腦中的Spike2軟件顯示電信號和腸蠕動信號，整

4、個實驗過程中在電腦中持續(xù)記錄，存盤后對原始數(shù)據(jù)進行下線分析(off-lineanaylsis)。 得到穩(wěn)定的基礎放電信號后，分別觀察器官浴槽中加入5-羥色胺(125μM、250μM，、500μM)、緩激肽(0.25μM、0.5μM、1μM)和機械壓力刺激(腸內壓升高60cmH2O)后腸系膜傳入神經放電的改變。對于同一個標本，只加入一個濃度劑量的5-羥色胺和緩激肽，每次實驗時隨機選擇二者的濃度直接加入器管浴槽中。，5-羥色胺和緩激

5、肽的在器官浴槽內的作用時間為兩分鐘。升高腸內壓時，將腸腔內灌流管的尾端夾閉，而頭端按照原速度持續(xù)灌流，經過大約90秒后腸內壓升高60cmH2O。施加刺激的順序為5-羥色胺、升高腸內壓和緩激肽。兩次刺激之間至少有15分鐘的平衡時間，待神經基礎放電穩(wěn)定后再施行下一個刺激。 根據(jù)動作電位的波形和波幅在Spike2軟件的幫助下可以將神經放電的信號與干擾信號分開，分別計算每秒鐘的最大放電頻率(峰放電頻率)以及刺激作用持續(xù)時間內的平均放電頻

6、率。以施加刺激前兩分鐘的放電頻率為基礎放電頻率，加入5-羥色胺和緩激肽后神經放電的改變分別以最大峰放電頻率的增加以及加藥后30秒、1分鐘以及兩分鐘內平均放電頻率的增加表示。腸內壓升高時，放電頻率的改變以腸內壓每升高10cmH2O時峰放電頻率和平均放電頻率的增加表示。所有數(shù)據(jù)以mean±SEM表示，各組之間行單因素方差分析。 結論：建立了離體記錄小鼠腸系膜傳入神經放電的模型。傳入神經放電表現(xiàn)壓力依賴性的增加。5-羥色胺和緩激肽可以

7、直接作用子傳入神經末梢的受體刺激漿膜側傳入神經，放電頻率的增加呈現(xiàn)劑量依賴性模式。 第二部分：吲哚美辛誘導腸炎后小鼠空腸腸系膜傳入神經敏感性的改變及其機制 目的：有些慢性腸炎病人雖然形態(tài)學檢查顯示腸粘膜有廣泛的炎性表現(xiàn)，但卻沒有明顯的腹痛癥狀。在本部分實驗中我們選擇吲哚美辛誘導的炎性腸病模型，觀察腸炎后空腸腸系膜傳入神經敏感性的改變，并進一步探討其機制。 方法：C57BL/6小鼠，分別在實驗的第一天和第二天早上8

8、點皮下注射吲哚美辛兩次(60 mg kg-1)誘導腸炎，對照組接受相同容積的酒精注射。實驗的第三天早上9點，動物在異氟烷麻醉狀態(tài)下做腹正中切口，肉眼觀察腸系膜粘附、腸道長度、腸充血以及潰瘍形成情況，對炎癥程度行大體評分。制備空腸石蠟切片，常規(guī)HE染色后鏡下進行炎癥評分。取2厘米長帶有完整腸系膜的空腸置于器官浴槽中，分離腸系膜神經記錄傳入神經放電。引導方法與第一部分相同，在記錄腸系膜神經放電的同時觀察腸蠕動性的改變。實驗標本至少平衡15分

9、鐘待信號穩(wěn)定后才正式開始實驗，施加刺激順序為5-羥色胺(250μM)、升高腸內壓(60cmH2O)和緩激肽(0.5μM)。實驗分為四組，分別記錄施加化學和機械刺激后腸系膜傳入神經放電的改變(n=6)。1)吲哚美辛注射誘導腸炎組；2)注射酒精的對照組；3)皮下注射吲哚美辛誘導腸炎，同時慢性腹腔注射誘導性一氧化氮合酶抑制劑L-N6-(1-iminoethyl)-lysine(L-NIL)(3 mgkg-1，1次/12小時，注射5次)；4)吲

10、哚美辛誘導腸炎，施加化學和機械刺激前10分鐘在浴槽中灌流含有L-NIL(30μM)的克氏液。記錄漿膜側施加5-羥色胺、緩激肽以及腸內壓升高時傳入神經峰放電頻率的增加。施加刺激前兩分鐘的峰放電頻率作為基礎放電頻率。所有數(shù)據(jù)以mean±SEM表示，各組數(shù)據(jù)之間用單因素的方差分析進行統(tǒng)計學分析(腸蠕動和化學刺激誘導神經放電數(shù)據(jù))，不同實驗組腸內壓變化引起傳入神經放電頻率的增加用雙因素方差分析，P＜0.05認為有顯著性差異。 結論：腸炎

11、時腸系膜傳入神經表現(xiàn)出誘導性一氧化氮合酶依賴性的敏感性下調，而這種敏感性的下調看起來不依賴于炎癥反應本身。提示腸炎時誘導性一氧化氮合酶依賴性的一氧化氮生成可以通過直接影響傳入神經的信號轉導來調節(jié)神經敏感性。 第三部分：DSS誘導結腸炎后結腸腸系膜傳入神經敏感性的改變及其機制 目的：腸炎可以誘導支配腸道的腸外在傳入神經的敏感化。本部分的研究中我們利用炎癥性腸病中的大腸炎模型研究腸炎時結腸傳入神經敏感性的改變及其機制。我們推

12、測結腸炎時結腸傳入神經的敏感性增加，肥大細胞和環(huán)加氧酶可能參與了這一過程。 方法：C57BL/6小鼠以3％右旋糖酐硫酸酯鈉(dextran-sulfate sodium，DSS)代水飲用，連續(xù)飲用7天誘導大腸炎，對照組正常飲水。第八天將動物麻醉，根據(jù)疾病活性指數(shù)對炎癥進行大體評分(體重、結腸長度、結腸重量/長度比值、脾臟重量、糞便連續(xù)性、是否有血便)。切除一段帶有完整腸系膜的近端結腸用于傳入神經放電記錄，與其相毗鄰的一段結腸制備

13、石蠟切片，常規(guī)HE染色，在顯微鏡下行組織學評分。將行電生理學記錄的近端結腸置于器官浴槽中，以克氏液持續(xù)灌流(含有1μM尼莫地平，抑制腸收縮)。腸系膜傳入神經的引導方法與第一部分類似。待放電信號穩(wěn)定后，先后施加機械刺激(腸腔擴張)和化學刺激(0.5μM)，觀察各實驗組動物傳入神經放電敏感性的改變。對照組腸段僅用克氏液灌流，來自大腸炎組的結腸標本分別用克氏液、含有肥大細胞穩(wěn)定劑Doxantranzole(10-4 M)或者含有環(huán)加氧酶抑制劑

14、萘普生(10-5M)的克氏液灌流(每組樣本數(shù)均為6)。在Spike2軟件的幫助下，根據(jù)神經放電動作電位的不同波形和波幅，可以進一步對全神經放電信號進行離線分析，分解出單根神經纖維，并記錄分離出的所有神經纖維的刺激前后總的放電頻率，計算施加機械和化學刺激后各實驗組傳入神經最大放電頻率的改變。所有數(shù)據(jù)以mean±SEM表示，各組數(shù)據(jù)之間以單因素方差分析進行統(tǒng)計學處理，P＜0.05為有顯著性差異。 結論：炎癥性腸病的大腸炎模型中，腸系